本期主要内容是分享冷冻保存后的hMSCs的如何复苏，hMSCs的传代培养具体的操作流程，成功复苏后操作传代培养，将hMSCs适应到MesenPlify™ sXF培养基，获得最终实验数据。

hMSCs复苏传代培养操作过程

冷冻保存的hMSCs的复苏

1、将MesenPlify™ sXF完全培养基提前恢复至室温或37°C。

2、将hMSCs冻存管放置在37°C的水浴中迅速解冻，直到观察到剩余的少量冰晶即将消失。

3、将冻存管内的细胞悬液转移到一个15或50mL锥形管中，缓慢地滴加10mL MesenPlify™ sXF完全培养基，轻柔混匀。

4、以300xg的速度在室温下离心5分钟收集细胞。 5、弃去上清液以去除二甲基亚砜(DMSO)保护剂。 

6、用1mL MesenPlify™ sXF完全培养基重新悬浮细胞。

7、进行细胞计数。

（注意：如果细胞密度超过细胞计数器的推荐范围，可能需要在培养基中进一步稀释样品。） 

8、按照较高的接种密度（5,000-7,000/cm2）将细胞接种到细胞培养容器中，使用MesenPlify™ sXF完全培养基补充至适当体积。

（TIPS：当细胞刚从冻存中复苏时，建议使用高的接种密度） 

9、在37°C、5% CO₂和饱和湿度的培养箱中培养细胞。

10、每隔3-4天使用预热至37°C的MesenPlify™ sXF完全培养基进行换液，或传代（当细胞汇合度达到70-80%时，具体操作步骤可参考下文“hMSCs的传代培养”）。

hMSCs的传代培养

1、检查hMSCs是否达到70-80%的汇合度。注意不要让hMSCs达到100%的汇合度，否则细胞可能会出现分化的迹象。

2、将MesenPlify™ sXF完全培养基提前恢复至室温或37°C。

3、用10mL的不含Ca++、不含Mg++的DPBS（不包含在套装中）轻轻洗涤细胞一次。

4、添加复温的0.125%胰蛋白酶消化液（稀释为0.5x使用）或重组胰蛋白酶消化液TrypLE（1×）（不包含在套装中），以覆盖整个组织培养瓶的表面。

5、轻轻旋转培养瓶，使胰蛋白酶均匀分布在表面上。

6、放在37°C培养箱中2-7分钟。 （TIPS：初次使用 MesenPlify™ sXF完全培养基应摸索合适的消化时间，若细胞刚从FBS培养基中转过来，可能需要5-7分钟。若细胞已完全适应无血清培养，消化时间可能缩短至2-4分钟。 细胞在无血清培养基中较容易消化脱落，此为正常现象，应注意避免消化过度的情况发生，推荐使用重组胰蛋白酶消化液 TrypLE（1×），若采用胰蛋白酶消化液，可稀释到 0.125%（0.5x）使用）。

7、使用相差显微镜检查细胞是否已脱落，轻轻敲击培养瓶的侧面以帮助脱落。 

8、一旦细胞脱落并自由漂浮，将MesenPlify™ sXF完全培养基添加到消化液体积的3倍，以终止消化。

9、将细胞悬液收集到一个50mL锥形管中。

10、以300xg的速度在室温下离心5分钟。 

11、弃去上清液以去除胰蛋白酶。 

12、用1mL MesenPlify™ sXF完全培养基重新悬浮细胞。

13、进行细胞计数。

（TIPS：如果细胞密度超过细胞计数器的推荐范围，可能需要在培养基中进一步稀释样品。）

14、计算所需的培养基体积，根据实验需要或视细胞状态，以常规的接种密度（3000-5000/cm2）或较高接种密度（5000-7000/cm2）将细胞接种到新的细胞培养器皿中。

15、使用MesenPlify™ sXF完全培养基补充至适当体积（可参考下表）。

16、在37°C、5% CO₂和饱和湿度的培养箱中培养细胞。 

17、每隔3-4天使用预热至37°C的MesenPlify™ sXF完全培养基进行换液，或传代（当细胞汇合度达到70-80%时）。

hMSCs的冷冻保存

1、通过添加20%二甲基亚砜（DMSO，套装中未提供）制备2x的冷冻保存液。

（TIPS：假设最终需要的细胞冻存体积为1mL，先准备500uL的2x冷冻保存液，配制方法是将100uL的100% DMSO加入到400uL的MesenPlify™ sXF完全培养基中）

2、将细胞复温至室温的MesenPlify™ sXF完全培养基中悬浮，使细胞的浓度为常规细胞浓度的两倍（例如2x106/mL）。

3、将步骤1中制备的2x冷冻保存液，以1:1的体积，缓慢地滴加到细胞悬浮液中，然后用移液管轻轻混合。（此时，冷冻液的浓度被稀释为1x，即DMSO的最终浓度为10%，细胞浓度为1x106/mL）

4、将混合好的细胞悬液，转移到预冷到2- 8°C的细胞冻存管中。

5、转入梯度降温盒，-80℃过夜，隔天转入液氮长期保存。

（TIPS：也可以购买其他商品化的hMSCs冷冻保存液进行冻存，操作步骤参见其说明书进行） 

hMSC的特性分析

可以使用流式细胞术、集落形成单位（CFU）分析以及多向分化分析对培养的hMSCs进行特性分析。 详情请参考指南手册获取信息(Guide Book: Human Mesenchymal Stem Cells)。

将hMSC适应到MesenPlify™ sXF培养基的过程

如果正在使用其他品牌培养基，可以直接切换到MesenPlify™ sXF体系，一般情况下无需进行预处理。当细胞刚从冻存中复苏时，也可先用原培养基进行复苏，随后在Day1更换为MesenPlify™ sXF完全培养基，后续即可正常使用MesenPlify™ sXF完全培养基培养或传代

将hMSC适应到MesenPlify™ sXF培养基的过程

仅供研究使用（RUO），或用于进一步制造。 

不适用于人类或动物诊断或治疗用途。 

产品按照ISO 13408和ISO 9001相关的质量管理体系进行制造。