导语
胶质母细胞瘤（GBM）干细胞中circMET高表达，同时鉴定出circMET可以在YTHDF2调控的m6A修饰基础上翻译产生MET404蛋白；MET404作为新鉴定的MET配体，MET404可以激活MET受体，刺激不依赖于HGF的下游效应物并驱动GBM的肿瘤发生。用EMT404的单克隆抗体增强了抗HGF/MET疗法的功效，可以作为治疗脑恶性肿瘤中的关键靶点。
研究背景
胶质母细胞瘤（GBM）是常见的原发性脑癌，即使采用了免疫治疗，GBM患者的生存期仍只有12-15个月。GBM表现出显著的瘤内异质性，其中高水平的MET表达在部分GBM肿瘤内被发现。
CircRNA是部分癌症中（包括GBM）的关键分子靶标；circRNA在IREB(内部核糖体进入位点)或m6A修饰的驱动下，可以编码功能性肽，进而影响癌症干细胞的自我更新和治疗抗性变化；同时研究显示：m6A阅读器YTHDF2的高表达与胶质瘤干细胞（GSC）的癌症特征保持有密切关联，m6A修饰位点也可以作为内部核糖体进入位点（IREBs），促进circRNA和核糖体的结合，提高编码能力。综上信息表明m6A修饰的circRNA有作为治疗靶标的潜力。
MET是GBM中除EGFR（约4%）外最显著改变的RTK之一（MET是一种受体酪氨酸激酶（RTK）），MET可以在癌症相关内皮细胞中检测到，对于新生血管的生成较为重要；原发性GBM的MET的表达频率从30%变化至100%，利用其先前鉴定的配体HGF（也经常在GBM中过表达），HGF/MET信号传导是GBM治疗中的合理靶标。然而，在目前的临床实验中，HGF靶向疗法和MET靶向疗法效果均不理想，酪氨酸激酶抑制剂（TKI）已被证明增加RTK突变，其损害治疗期间的结合能力和治疗效果。
本研究中，有编码潜力的circMET（circMET编码蛋白质MET404）在GBM中高表达，MET404可以驱动GBM肿瘤的发生，同时MET404和MET β亚基形成嵌合MET受体，该受体会直接激活下游效应子从而不依赖HGF刺激；实验结果表明：奥奴珠单抗和MET404抗体的组合最大限度地抑制小鼠GBM异种移植物进展并延长小鼠总体存活，展示了靶向MET404在GBM中的未来转化前景。
研究思路
研究结果
1.CircMET是一种具有潜在编码能力的circRNA
GBM进行circRNA-seq和m6A-seq研究鉴定到1425个m6A修饰的circRNA，通过circRNA-seq鉴定了其中的1005个有高丰度m6A修饰的circRNA。m6a修饰的circRNA在多个RTK（络氨酸激酶）途径富集；RNC-seq，鉴定到1605个差异RNC-circRNA，鉴定circRNA（find_circ/CIRIquant）。结合上文鉴定的m6A修饰的circRNA，在GSC和NSC之间鉴定到89个有m6A修饰位点差异且具有编码能力的circRNA；同时鉴定到255个与YTHDF2相关的circRNA，其中5个与89个重叠；综上鉴定了5种候选circRNA（circMET、circSPECCl、circXYLTl、circCDYL和circRBM 33），这5种circRNA中，circMET在GBM肿瘤发生中具有关键作用，作为host circRNA进行进一步研究。
2.CircMET编码蛋白MET404，YTHFD2的结合是circMET翻译所必需的
CircMET是由MET基因的exon2形成，CircMET的序列在人、猕猴、大小鼠中是高度保守的，使用sanger测序验证了CircMET（1214nt），并预测了其circRNA特征包括编码能力。亚细胞定位显示CircMET主要位于细胞质中，在GSC中特异性高表达；m6A-IP，验证了CircMET的m6A修饰位点（TransCirc数据库）；RNC-seq结果显示，在多聚核糖体分级中可以检测到CircMET，说明CircMET具有翻译能力；CircMET可以编码蛋白质（MET404）,为了验证MET404是由CircMET产生的，对MET进行外显子的crispr敲除，敲除外显子3并没有影响MET404的表达；在circMET KO小鼠的多个器官中MET404表达显著减少和未受影响的MET表达进一步表明circMET编码该蛋白质。
m6A读取蛋白YTHDF2对于circMET翻译是必需的：GSC细胞敲除YTHDF2（KD），敲除后不会影响circMET表达，但会降低MET404蛋白水平；借助RIP证实了YTHDF 2/circMET相互作用；针对临床GBM和正常样品进行检测，结果显示MET404在癌症组织中会特异性的高表达，而且高MET 404表达预测GBM患者更差的总体存活率；IHC空间共定位结果显示，MET404和YTHDF2在空间上存在共定位表达。
3. MET404通过激活MET信号传导促进GBM肿瘤发生
MET404主要定位到细胞膜上，对circMET进行沉默或过表达操作的细胞进行RNA-seq，差异基因主要富集到络氨酸激酶（RTK）途径及肿瘤相关途径，意味着MET404参与多种癌性信号传导途径；circMET沉默细胞中，pMET被显著抑制，且其下游活化（p-AKT，p-ERK）受到抑制。小鼠移植肿瘤发生检测结果显示，MET404的移植小鼠中，移植肿瘤后小鼠的存活时间显著升高，过表达后进一步增强了GBM的进展。
大多数MET 404 KI(基因编辑-基因插入重组)小鼠在20周时已经发展出脑肿瘤，肿瘤表型与GBM类似，具有高度活化的MET信号，且MET404KI小鼠存活率更低，可以表明MET404通过激活MET信号传导，进而诱发GBM的肿瘤进展。
4.MET404与METβ亚基相互作用激活MET受体
MET404激活MET信号传导的机制：氨基酸序列分析表明MET404具有分泌信号肽的特征，对GSC的培养基上清液IB分析表明MET404被分泌到了细胞培养液中，同时也在GBM的脑脊液中检测到了一定浓度的MET404（ELISA检测）；研究使用纯化的MET404梯度浓度液可以激活MET下游信号传导（MET404抗体可以中和），且可激活MET KO的受抑制的MET信号转导通路；综上，可以说明MET404通过MET受体发挥其作用。
MET404免疫沉淀质谱（IP-MS），鉴定了194个潜在结合蛋白。对潜在蛋白进行富集分析也显著富集到了细胞外定位和分子相互作用的GO功能，与MET404作为分泌蛋白的作用一致；Reactome通路分析揭示，MET404互作蛋白与RTK途径高度相关，特别是MET信号高度相关（MET活性、RAF/MAP激酶级联和MAPK家族信号传导级联的调节）；借助STRING数据库，基于鉴定的MET404结合候选蛋白，建立了以MET为枢纽的蛋白互作网络，该网络包括3个MET直接结合蛋白和42个间接相互作用蛋白；后续通过相互IP验证了GSC细胞中的MET404/MET相互作用，免疫荧光（IF）结果显示：MET404和MET共定位，且多位于细胞膜上。
MET404/MET受体结合位点鉴定：使用ClusPro服务器，模拟MET404和MET在胞外域形成的复合物，稳定的复合物结合位点为542-650残基（蛋白质中残基的顺序对其功能至关重要，并决定其三维结构），研究合成了全长MET受体和几个短的MET受体结构域与纯化的MET404，以鉴定MET上与MET404结合的具体结构域，MET 404与MET受体的PSI+IPTl结构域相互作用，HGF与MET受体的SEMA结构域相互作用，突变了MET404的几个残基，发现Q328和D358的两个单一突变充分损害了相互作用；同时用MET404处理比HGF处理可以更早地激活p-MET和下游效应子，并且用MET 404和HGF的组合处理对p-MET活化发挥协同作用。
HGF KO细胞系中可以观察到轻微p-MET下调，纯化的MET 404添加可以增强p-MET和下游信号转导，即单独的MET 404也可以激活MET受体；RTK的活化需要配体结合后的二聚化，引出问题，单独的MET 404是否可以诱导MET受体的二聚化；HGF KO细胞系，通过添加纯化的MET 404可以增强MET的二聚化；研究使用NanoBit系统，将大位（LgBit）和小位（SmBit）残基融合至MET单体。MET的二聚化导致这些残基的近似，并因此产生发光信号。将大位（LgBit）和小位（SmBit）残基融合至MET单体。MET的二聚化导致这些残基的近似，并因此产生发光信号。综上，证实了MET404单独诱导MET二聚化和活化的能力。向MET 404 KO细胞中添加HGF也增加p-MET和p-AKT水平。综上，可以证实，HGF和MET404独立地激活MET受体并协同作用以最大化MET信号传导。
MET受体由α和β亚基形成，这两个亚基都是通过切割全长MET产生的；MET外显子2KO消除了MET受体和MET 404的表达两者，且使用HGF或MET404均无法激活下游信号转导（p-AKT、p-ERK），然后重新表达β亚基，并用HGF或MET404进行刺激，HGF无法激活（支持经典MET工作模型需要α亚基的结论），但MET404可以激活p-MET和p-AKT，表明MET404可以与METβ亚基形成复合物激活MET受体；鉴于MET404的异常表达，数据表明MET404是GBM中过度活化的MET信号转导的关键激活剂。
5.靶向 MET404 和 onartuzumab（抗MET受体） 在抑制 GBM 进展方面的协同作用
GBM临床样品中，观察到MET404和MET的共定位，且MET404与p-MET水平相关（比p-MET与EMT受体的相关性更高），即MET404是GBM种p-MET的主要激活剂。MET404抗体的梯度添加可以逐步降低GSC细胞中的p-MET水平，说明MET404有作为GBM中靶向治疗靶点的临床潜力；同时MET404与onartuzumab组合可以更好地一直MET信号和下游事件，包括AKT/ERK活化和细胞活力。在小鼠肿瘤移植实验中，MET404抗体与onartuzumab单抗联合治疗实现了MET磷酸化和肿瘤进展的部分抑制，即抗体组合在抑制异种抑制物生长和延长小鼠存活方面发挥了更好的作用。
研究结论&结果讨论
本次研究中发现，MET404结合MET受体上远离HGF结合位点（SEMA）的不同结构域（PSI+IPT1），MET404结合MET受体上远离HGF结合位点（SEMA）的不同结构域（PSI+IPT1），导致MET信号的独立激活和与HGF联合使用时的协同效应。HGF作为典型的MET配体，与具有不同位点的MET单体结合，因此形成四个界面以促进更延伸的构象以引发活化。研究验证了MET404具有诱导MET单体二聚化的能力，MET404激活MET受体的潜在结构基础值得进一步研究，以优化抗MET404策略。
综上，本研究工作确定了GBM含有circMET产生的分子靶标MET404，作为新鉴定的MET配体，MET404激活MET受体，刺激不依赖于HGF的下游效应物并驱动GBM的肿瘤发生。用EMT404的单克隆抗体增强了抗HGF/MET疗法的功效，可以作为治疗脑恶性肿瘤中的关键靶点。
CircMET可以吸附miRNA以调节Snail/CXCL 10轴来驱动肝细胞癌中的免疫抑制；本次研究数据证实了MET404（不是其RNA，通过放回MET 404 ORF而不是突变体circMET RNA来恢复circMET损失后的表型）在形成GSC恶性肿瘤中的关键作用，其他研究中circRNA编码的功能肽已被证明是癌症或其他疾病中的关键参与者，这些发现也表明了不同病理条件下复杂的circRNA功能。
参考文献
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