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小编最近模仿该思路筛选与免疫周期相关基因，果不其然筛选的效果非常好！该思路可做纯生信，即筛选基因+单基因分析/基因集分析，或者干湿结合，即筛选基因+单基因分析+实验验证。想做类似分析的朋友欢迎交流！
小编一直觉得单基因泛癌的文章进可攻（纯生信发文）退可守（补实验）。小编已经有不少客户发了单基因生信文章后，开始做实验进行深入研究，后续可以继续发文章写基金。比较老的客户已经成功拿到经费。
之前小编写过生信筛选的单基因如何补充实验
当时小编列举了一些实验，本文作者做了表达验证，预后验证，与免疫检查点的相关性，分子机制，对CD8T细胞浸润的影响，与免疫检查点抑制剂的连用。本文属于生信与实验结合的十分紧密的文章。对于有时间有经费的朋友，在筛选到好的基因后，也可以参考这些做后续的研究。下图中打勾的都是本文做了的内容。
研究背景：肝细胞癌(HCC)是全球导致癌症相关死亡的第三大原因，在一线和二线临床环境中，III期临床试验未能显示免疫检查点封锁剂治疗的益处。当使用这些药物作为HCC的单一治疗时，其有效范围在15%到20%之间。现有免疫检查点封锁疗法的主要局限性在于多种免疫检查点通路，以及免疫细胞不浸润肿瘤，免疫细胞过度衰竭。因此，识别新的免疫检查点和开发新的联合治疗已成为HCC免疫治疗研究的主要重点。
锌指蛋白207(ZNF207)是ZNF蛋白家族的一员，在人类胚胎干细胞的自遗传、多能性和分化中发挥重要作用。HCC细胞中ZNF207的表达升高，这与预后不良相关，但具体机制尚未阐明，其在肿瘤免疫中的作用尚未确定。
研究结果：
一、ZNF207是HCC中潜在的免疫抑制靶点
1、使用癌症免疫周期评分和HCC转录组数据进行WGCNA网络分析，发现了两个具有相似的内部表达模式的聚类(图1A)。聚类1中的模块与癌症免疫周期的步骤1-4呈正相关，而聚类2中的模块与步骤5-7呈负相关(图1B)。
2、棕色模块基因富集在免疫相关信号通路显示正相关的癌症免疫周期(图1C)，而绿松石基因模块主要富集在RNA运输、RNA剪接和纺锤体组装过程显示负相关步骤5-7的癌症免疫周期(图1d)。
3、从两个标准中筛选了绿松石色模块中的核心基因。DEAHbox蛋白9(DHX9)和ZNF207均符合筛选标准(图1E)。
4、对22份临床HCC样本进行RT-qPCR检测，发现ZNF207与CD4、FOXP3、CD11b、CD68呈很强的正相关。CD8A、C2、C3和细胞毒性T细胞、补体免疫反应相关（图1F-I）
二、ZNF207在HCC中高表达，并与不良预后相关
1、ZNF207在HCC组织中的表达量高于邻近样本(图2A)；来自Oncomine和GEO数据库的数据显示出了一致的趋势(图2B、C)；在HCC样本中，ZNF207在转录和翻译水平上均显著增加(图2D、E)；免疫组化(IHC)分析显示，ZNF207主要在细胞核中过表达(过表达(OE))，这与其作为转录因子的作用相一致(图2F)。
2、在ZNF207高表达组中，HCC患者表现出更多的晚期、分级和T期(图2G)，在多个数据集中也表现出更短的总体和无病生存结果(图2H)
三、缺氧使HCC中的ZNF207升高
1、通过基因集合富集分析(GSEA)发现“HYPOXIA_VIA_HIF1A_UP”基因特征在ZNF207高组中显著富集(图3A)。
2、在实验中，我们观察到物理和化学模拟的缺氧都可以提高ZNF207的蛋白水平(图3B、C) ；相比之下，BAY87-2243在缺氧条件下对ZNF207有较强的抑制作用(图3D，E)。过表达HIF1α和HIF2α，我们发现缺氧对ZNF207的影响可重复(图3F，G)。
3、使用双荧光素酶报告基因实验分析HIF对ZNF207的转录调控作用，结果表明缺氧和氯化钴均增强了ZNF207启动子基因的荧光强度(图3H)；CHIP实验验证结合位点（图3I）
4、在常氧和缺氧条件下，位于TSS-1012/-1017bp的DNA序列与抗HIF2α抗体免疫沉淀(图3J)。简而言之，缺氧可以通过转录调控来提高HCC中ZNF207的表达。
四、ZNF207促进与CD8+t细胞浸润和衰竭相关的HCC
1、ZNF207-KD或ZNF207-OE并没有改变免疫缺陷小鼠中异种移植瘤的生长速率(图4A，B)；ZNF207-KD或ZNF207-OEHepa1-6细胞显著影响肿瘤生长速率，但体外细胞增殖无差异(图4C、D)；ZNF207-KD或ZNF207-OE腺相关病毒8显著改变了免疫活性小鼠(BALB/c小鼠)的肿瘤生长(图4E)
2、ZNF207-KDHepa1-6细胞的条件培养基对自然杀伤细胞、B细胞和巨噬细胞没有明显的趋化作用，而对CD8+T细胞有明显的趋化作用(图4G)；条件培养基在体外也抑制了CD8+T细胞的衰竭(图4H)，从而提高了其增殖和细胞因子分泌水平(图4I)
3、在TCGA-LIHC数据集中，ZNF207与耗尽的t细胞基因特征和免疫检查点分子呈正相关，与实验结果一致(图4J，K)。
五、ZNF207通过MAPK-CX3CL1轴抑制CD8+t细胞浸润
1、GSEA结果显示，ZNF207-KD组的免疫和代谢相关信号通路显著富集(图5A)；趋化因子，细胞因子-细胞因子受体的相互作用，t细胞受体信号通路表达上调(图5B)。
2、一些细胞因子与t细胞的趋化性密切相关，CX3CL1在上清液和裂解液中有一致的趋势(图5C)。
3、通过ELISA证实了细胞上清液中CX3CL1的上调(图5D)。此外，在人类HCC样本中，ZNF207和CX3CL1之间存在很强的负相关关系(图5E)。
4、当用CX3CL1中和剂处理时，条件培养基对CD8+T细胞的趋化作用减弱(图5F)，说明ZNF207-kd诱导的CX3CL1分泌是否对CD8+T细胞的趋化性至关重要
5、联合生存分析还显示，CX3CL-1低ZNF207高组患者的总生存期(OS)最差，HR最高，而CX3CL1高ZNF207低组患者的生存结局最好(图5G)
6、MAPK信号通路在ZNF207-KD组中显著富集(图5A，H)。证实了p38MAPK抑制剂(SB203580)可以直接抑制Hepa1-6细胞中的CX3CL1，而ZNF207-KD对CX3CL1的过表达也可以被SB203580逆转(图5I，J)。
六、ZNF207通过增加核嘌呤水平促进CD8+t细胞衰竭
1、与途径富集结果一致，ZNF207-KD处理后，以氨基酸为代表的代谢物差异显著(图6A)。
2、ZNF207-KD后，色氨酸代谢途径中的代谢产物水平，包括嘌呤的代谢产物水平被显著抑制(图6B)；ZNF207-kd抑制了细胞上清液中的核嘌呤水平，而增加了ZNF207的稳定表达(图6C)
3、补充嘌氨酸显著诱导了CD8+t细胞衰竭(图6D)
七、ZNF207转录调控IDO1促进肾苷的产生
双荧光素报告基因和CHIP实验结果表明ZNF207可结合到IDO1启动子区(图6E-F)；用特异性抑制剂PF-06840003抑制IDO1，可逆转ZNF207表达介导的kynurenine 水平(图6G)；PF-06840003处理逆转了来自ZNF207-OE细胞系的条件培养基引起的CD8+t细胞衰竭(图6H)
八、ZNF207是联合抗pd1治疗的潜在治疗靶点
1、ZNF207-KD联合PD1单克隆抗体可抑制肿瘤生长，具有突出的肿瘤抑制作用(图7A-C)
2、ZNF207-KD+抗PD1治疗组PCNA阳性细胞比例最低，而浸润性T细胞明显增加(图7D)
3、使用肿瘤免疫功能障碍和排除(TIDE)子图算法来预测TCGA-LIHC数据集中不同ZNF207表达的患者的免疫治疗反应率(图7E)
4、ZNF207低表达组对免疫治疗更为敏感、(图7F)；ZNF207低表达组的患者对PD1单克隆抗体治疗的反应优于CTLA-4单克隆抗体(图7G)。
5、图7H显示了缺氧如何通过HIF蛋白转录提高ZNF207
总结：
在本研究中，系统结合生物信息学方法和实验技术，评价免疫抑制靶点ZNF207在HCC的体外和体内的作用。抑制ZNF207增强了cx3cl1诱导的CD8+T细胞向肿瘤组织的趋化性。此外，沉默ZNF207通过抑制IDO1的转录调控，减少了嘌呤的合成，从而反过来逆转了CD8+t细胞的衰竭，从而重塑了肿瘤微环境。此外，还验证了其作为抗程序性细胞死亡蛋白1(PD1)治疗的生物标志物和联合靶点的潜力。最后研究了ZNF207异常表达在HCC中的作用及其在CD8+t细胞调控方面加速HCC进展的机制。本研究详细阐述对HCC进展激活机制的理解，并为HCC的治疗和预后提供潜在的治疗靶点。
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