pVACtool是一个癌症免疫治疗工具套件，由四个工具组成，分别是pVACseq、pVACfuse、pVACvector和pVACviz。其中pVACseq是一个癌症免疫疗法流程，用于从肿瘤突变中识别并优化候选的肿瘤抗原。这里介绍pVACseq-docker (DNA)的使用。

官网：pVACseq — pVACtools 4.0.5 documentation

下载（不用安装）

docker pull griffithlab/pvactools

使用

输入文件（vcf）处理

官网看起来很麻烦，共5个步骤，每个步骤似乎很多步，但其实还好，主要步骤仅1个。

1. 需要提供GT，（一般vcf都有，不用处理）；

2. 采用两个插件进行vep注释；

注意：若未安装vep，先安装vep，再进行以下操作。

    1）安装相关插件到指定目录

docker run -v /VEP plugins directory/:/work/ griffithlab/pvactools pvacseq install_vep_plugin /work/

或者：

    进入docker，运行pvacseq install_vep_plugin <VEP plugins directory>

    2）vep注释 --plugin Frameshift --plugin Wildtype --tsl

docker run --user root -v /data/database/vep_data/:/root/.vep/ -v /data/database/:/database/ -v /data_storage1/new_pipeline_RD/HLA/:/work --rm ensemblorg/ensembl-vep:release_104.1 vep -i /work/test.vcf -o /work/test.vep.vcf --format vcf --vcf --cache --refseq  --exclude_predicted --transcript_filter "not stable_id match NR_" --force_overwrite --pick --fork 4 --offline --assembly GRCh38 --fasta /database/GRCh38/Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz --plugin Frameshift --plugin Wildtype --tsl

3. 需要AD, DP, and AF（一般vcf都有）

    若无AD，DP，AF，但有DP4和VAF，则可命令行处理：

less test.vcf|perl -ne '{chomp; if(/^#/){print $_,"\n";}else{@a=split; $f=$a[8]; @fs=split /:/, $f; @vn=();foreach $v(@a[9..$#a]){@vs=split /:/, $v; for($i=0;$i<@fs;$i++){if($fs[$i] eq "DP4"){@d=split /,/, $vs[$i]; $d=$d[0]+$d[1]+$d[2]+$d[3]; $ad=($d[0]+$d[1]).",".($d[2]+$d[3]);} } push @vn, join(":", $v, $d, $ad); } $f=~s/VAF/AF/; $f.=":DP:AD"; print join("\t", @a[0..7], $f, @vn),"\n";} }'|less >test.addAD.vcf

bgzip test.addAD.vcf

tabix test.addAD.vcf.gz

 4. 其他（表达数据和phased vcf）可选，但考虑准确性，官网强烈建议进行phased vcf。

运行

只分析MHC_Class_I：
docker run -v /local_data/:/work/ griffithlab/pvactools pvacseq run --iedb-install-directory /opt/iedb/ -e1 8,9,10,11 /work/test.addAD.vcf.gz TUMOR HLA-A*24:02,HLA-B*48:01,HLA-C*07:02 NNalign NetMHC NetMHCIIpan NetMHCcons NetMHCpan PickPocket SMM SMMPMBEC SMMalign /work/test_outdir

注意：

1. TUMOR是样本名，与对应vcf文件对应。

2. 一定要指定IEDB本地路径：--iedb-install-directory /opt/iedb/， 不然刚开始能跑通，但调用过多后会报错，Error posting request to IEDB. You don't have permission to access /tools_api/mhci/ on this server.

参数测试

测试参数--normal-sample-name NORMAL

结果：与无该参数的结果一模一样，但速度貌似要快一些（24min）。

测试allele：

对比HLA各一个（HLA-A*24:02,HLA-B*48:01,HLA-C*07:02）和杂合2个分型（HLA-A*24:02,HLA-A*02:06,HLA-B*48:01,HLA-B*40:01,HLA-C*07:02,HLA-C*08:01）

运行命令：

docker run -v /local_dir:/work/ griffithlab/pvactools pvacseq run -t 8 -e1 8,9,10 --iedb-install-directory /opt/iedb/ /work/t.vcf.gz TUMOR HLA-A*24:02,HLA-B*48:01,HLA-C*07:02 NetMHCcons /work/test_out -m median -b 1000 -c 1 --fasta-size 100 --downstream-sequence-length 100

docker run -v /local_dir:/work/ griffithlab/pvactools pvacseq run -t 8 -e1 8,9,10 --iedb-install-directory /opt/iedb/ /work/t.vcf.gz TUMOR HLA-A*24:02,HLA-A*02:06,HLA-B*48:01,HLA-B*40:01,HLA-C*07:02,HLA-C*08:01 NetMHCcons /work/test_out_all -m median -b 1000 -c 1 --fasta-size 100 --downstream-sequence-length 100

运行时间：前者8分钟，后者13分钟；

结果：后者多预测很多新抗原，且得分低很多，前40个中仅3个被前者预测出来；前者的很多新抗原结果后者未预测出来。

报错

报错The two methods NetMHCpan and NetMHC produced different outputs, number of peptides not the same：

1 经测试，重新运行又成功，可能是随机错误；同见https://github.com/griffithlab/pVACtools/issues/324

2 为简化运行，参照https://github.com/griffithlab/pVACtools/issues/328修改参数：

docker run -v /local_dir/:/work/ griffithlab/pvactools pvacseq run -t 8 -e 8,9,10 -m median -b 1000 -c 1 --fasta-size 100 --downstream-sequence-length 100 --iedb-install-directory /opt/iedb/ /work/t.vcf.gz TUMOR HLA-A*24:02,HLA-B*48:01,HLA-C*07:02 NetMHCcons /work/test_out - 

运行成功，时间节省2/3（8min）；该命令大部分样本不再报错，但偶尔个别样本仍报同样的错，经重跑又成功。

结果对比：

1）预测的新抗原序列大部分一样，除了前4个有3个一样外，其他的顺序不一样；

2）打分不一样，简化后（仅NetMHCcons ）的打分低一些（最低26分），原始（多算法）打分高一些（最低107分）。