abstract 基因表达的可以实时定量检测亚细胞分辨率IAA浓度的biosensor
Summary of the design process.
1A 吲哚乙酸和色氨酸的结构：IAA类似于色氨酸:都含有一个吲哚环，其3位连接色氨酸中的一个氨基酸部分和IAA中的一个羧基
1B 二聚体TrpR在与TRP结合后发生构象变化，融合到TrpR（色氨酸阻遏物）上的荧光蛋白可以中继这种变化，产生荧光共振能量转移(FRET)信号，作为体内测量的方便读数。开发一种生长素特异性、基因编码的FRET生物传感器。只有在IAA(红色)存在的情况下，荧光团(mNeonGreen和海蓝宝石)才足够接近和正确的方向进行能量转移(EFRET)。
1C 提高IAA结合的亲和力和特异性，同时废除TRP结合。假设TRP和IAA的吲哚环具有相似的结合模式，并将设计重点放在如图所示框内TrpR与配体结合的结构，紫色表示与这个结构相互作用的侧链，其中T44和L43是第二条TrpR的侧链。本研究中进一步突变的残基用箭头表示。
详细介绍了设计过程中最重要的部分，二聚体结合部位的改造情况。Structure of AuxSenand critical steps in the engineering process. （阻止原来的trp结合，促进IAA结合）
2AB TRP通过与周围蛋白质残基的相互作用而固定，而IAA结合则没有这种稳定性，不被固定。
2C 将TrpR上与Trp结合并且起到连接作用的氨基酸先用多重碱基重叠的引物 突变成所有可能的氨基酸，然后再进行筛选，得到了特异识别IAA的变体，从氨基酸突变中筛选出来的变体，在88位发生了丝氨酸向酪氨酸的突变(S88Y)，由于Y88侧链粗大，完全阻断了TRP的结合，同时通过IAA的羧基与R84的胍基和Y88的羟基相互作用，有利于IAA的结合
2D 通过优化IAA的吲哚环与TrpR结合处的疏水相互作用，进一步提高了IAA的亲和力
作者还排除了IAA类似物可能与IAA竞争，接着再对萤光团组合进行筛选，再将把萤光团和二聚体连接起来的linker也进行了优化，使它变短更利于能量传播。最终得出的传感器模式如图所示，
1D 传感器设计的主要步骤(AuxSen)，以及它们对FRET比率变化的累积贡献(ΔFRET)与IAA浓度的关系。
FRET ratio of AuxSenin response to auxin treatment. 这种基于FRET的传感器可以报告瞬时生长素积累的动态，也可以亚细胞定位生长素的积累位置。
（b图看不懂...）
3AB，基线FRET信号被认为反映了原生质体中生长素的内源水平，因此传感器的灵敏度足以报告内源生长素的水平
3c–f,为了检测对生长素的反应，用10μM IAA处理幼苗，并记录了随时间推移的FRET信号
3CD 10μM IAA ,间隔10min去检测信号强度，发现10min后，根核内的FRET信号达到最大值，然后在50min内保持不变；相比之下，用DMSO处理无变化。
3EF 为了揭示核生长素积累的速度，测量了较短时间间隔的FRET。最大值在2分钟内达到，仅1分钟就达到了80%以上的信号强度。因此，从细胞外间隙摄取生长素似乎是非常有效的。
3GH 然后，通过清洗IAA来研究核积累的可逆性。在10μM IAA中培养10分钟后，将培养基换为二甲基亚砜。FRET比率逐渐下降，30分钟后几乎达到处理前的值，这表明IAA从细胞外流缓慢。延长IAA孵育时间为1h，这加速了IAA的外流，使FRET比率在IAA清洗后10分钟内就降至处理前的水平。（RT-qPCR，这种外流时间长短和PIN外流载体的表达水平相关）
小结 数据表明，IAA的摄取是一个结构性的、快速的过程，而细胞的外流是根据需要发生的，就像生长素调节自己的输出一样。
3IJ 为了探索生长素是否可能在其他亚细胞中积累，原来的将AuxSen靶向内质网(ER)的腔。
FRET ratio of auxin sensor inresponse to redistribution of endogenous auxin.这个生长素传感器报告了内源生长素积累的快速和可逆的重新分配。
4AB 与前人研究一致，生长素在根尖静止中心富集较多。为了评估运输对生长素稳态分布的贡献，抑制生长素外排转运蛋白PIN1处理植物，发现与对照组相比，处理组的IAA浓度升高。这种增加可能是由于根尖正在进行的IAA合成，而外流受到损害，这与前人研究结果一致。我们得出结论，AuxSen报告了内源生长素分布的扰动，这突显了其在生长素检测中的特异性。
前人研究表明，改变根部生长方向涉及到内源生长素在根尖内的重新分布。
4 CD 将幼苗根以近垂直的位置放置1h，然后将其方向改变135°，并随着时间的推移再改变根的角度，监测核FRET比率。结果和前人的研究一致，重力刺激引起了根尖生长素运输系统的快速和可逆的反应，并且感受器可以感受到这种变化。
summary
作者设计产生了一种新的传感器，AuxSen，用于普遍存在的植物信号分子生长素。从色氨酸阻遏物（TrpR）出发，优化了IAA结合的亲和力和特异性，并通过FRET对的选择和连接子的优化提高了信号强度。该检测系统可以可视化生长素的动态重新分布以及生长素的亚细胞库，这是目前使用的生长素报告器无法实现的。
参考文献
1. Herud-Sikimic, O., et al., A biosensor for the direct visualization of auxin. Nature, 2021. 592(7856): p. 768-772.
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