在蛋白质相互作用研究领域，酵母双杂交和Pull-down等技术做出了巨大贡献，但它们在成本和实验周期上存在一定局限性。近年来，随着深度学习算法的发展，Megadock、AlphaFold-Multimer、Hdock等智能蛋白互作筛选工具，凭借其高分辨率、高通量和高准确度的优势，成为农林科技创新和生物医药研发中靶标发现与验证的利器。
今天，就让我们跟随小源，一窥AI数字化时代下的蛋白质互作研究方法！
一、案例展示
基于AI数字化平台的整体研究策略可以考虑采用以下系统化工作流程：
1.三维结构建模阶段
1.1 选用SWISS-MODEL、ESM-Fold和AlphaFold等多平台算法
1.2 构建高精度蛋白质三维结构模型
1.3 建立数字化蛋白质组学文库
2.互作预测筛选阶段
2.1 进行两至三轮精细化虚拟筛选：
蛋白-蛋白相互作用（PPI）预测
蛋白-核酸相互作用（PNI）分析
蛋白-小分子化合物相互作用（PCI）评估
2.2 筛选潜在生物靶标
3.下游实验验证阶段
3.1 采用多维度验证技术：
酵母单杂交系统（Yeast One-Hybrid，Y1H）
酵母双杂交系统（Yeast Two-Hybrid，Y2H）
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）
电泳迁移率实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）
双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation，BiFC）
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拉下实验（Pull-down）
双荧光素酶报告基因检测（Dual-Luciferase Reporter Assay，Dual-LUC）等
3.2 进行分子机制解析和功能确认
下面我们浅谈一下AI数字化技术在蛋白互作研究方面的应用情况。
二、蛋白质三维结构预测分析
2024年5月，美国布鲁克海文国家实验室John Shanklin教授团队在《Science Advances》期刊发表题为"Molecular mechanism of trehalose 6-phosphate inhibition of the plant metabolic sensor kinase SnRK1" 的论文中，揭示了在高糖胁迫条件下，海藻糖6-磷酸（T6P）与SNF1相关蛋白激酶1（SnRK1）主要催化（α）激酶亚基KIN10的结合，会抑制KIN10被GRIK1在T175位点磷酸化及激活的过程，导致SnRK1下游靶蛋白的磷酸化水平降低，进而促进植物细胞代谢状态从分解代谢向合成代谢的转变。该研究团队首先基于SWISS-MODEL算法构建了拟南芥KIN10的高精度结构模型，随后运用HADDOCK分子对接技术系统鉴定了T6P与KIN10相互作用的三种潜在结合模式：
图1：KIN10上T6P结合位点的三种潜在结合模式图；4A：haddock 2.4进行分子对接出的T6P结合，4B：MD模拟出的三种结合模式
同时，AlphaFold算法对KIN10-GRIK1蛋白质复合物进行了高精度结构建模：
图2：AlphaFold算法建模；KIN10-GRIK1蛋白质复合物示意图；KIN10显示为灰色，GRIK1显示为洋红色
三、数字化文库互作筛选
突尼斯大学的Abdelmonaem Messaoudi教授团队于2024年5月发表的题为“Core proteome mediated subtractive approach for the identification of potential therapeutic drug target against the honeybee pathogen Paenibacillus larvae”研究论文中，科研人员从幼虫芽胞杆菌中鉴定出对病原体生存至关重要且尚未用于抗生素治疗的潜在治疗靶点--ACP合酶III ，并在含36,043种化合物的植物化学物质库中筛选出ACP合酶III的三种抑制剂配体，特别是抑制剂配体 ZINC95910054有望成为抑制幼虫芽胞杆菌和控制美洲蜂幼虫腐臭病（AFB）的候选药物。
图3：ACP 合酶III与得分最高的三种抑制性配体间相互作用的3D和2D示意图
四、蛋白互作验证
河北农业大学农学院肖凯教授团队发表在植物学知名期刊《Plant Biotechnology Journal》的研究"Wheat TaPYL9‐involved signalling pathway impacts plant drought response through regulating distinct osmotic stress‐associated physiological indices"中，该研究为探究干旱胁迫条件下TaPYL9及其下游信号通路蛋白间的相互作用机制，首先利用SWISS-MODEL算法构建了TaPYL9蛋白的三维结构模型，随后结合Y2H、BiFC、Co-IP和Pull-down技术进行多维度验证。
图4： TaPYL9、TaPP2C6、TaSnRK2.8和TabZIP1之间的蛋白片段相互作用；4b：Y2H实验，4c：BiFC实验，4d~f：Co-IP实验，4g~i：Pull-down实验
上海交通大学马超教授团队近期在《Advanced Science》杂志发表的“Hierarchical Regulatory Networks Reveal Conserved Drivers of Plant Drought Response at the Cell-Type Level”研究论文中，科研人员在机器学习算法分析近30,000个跨物种的多组学数据样本的基础上，采用AlphaFold 3预测联合BiFC及Y2H的检测方法，证实了干旱胁迫响应中CIPK23和VvCBL4间的相互作用。
图5： CIPK23和VvCBL4间的相互作用；6E：AlphaFold 3预测结果（ipTM = 0.8），6F：以烟草叶片作为实验材料的BiFC实验，6G：Y2H实验
