在肿瘤研究领域，转移是导致患者死亡的首要原因，但其复杂的分子机制长期以来难以被系统解析。传统研究方法局限于低通量验证，无法全面捕捉肿瘤演进过程中的基因功能差异。张锋和Phillip A. Sharp团队首次在活体动物模型中成功实施了全基因组规模的CRISPR/Cas9基因敲除筛选，系统性地挖掘出驱动肿瘤生长和远端转移（特别是肺转移）的关键基因。它不仅证明了CRISPR筛选技术在体内研究中的巨大威力，更为我们理解癌症这一复杂疾病的进化过程提供了前所未有的高清“路线图”。
一、核心研究方法
传统上，研究特定基因功能需要逐一敲除或过表达，效率低下。而这项研究采用了一种革命性的“池式筛选”策略，其核心设计巧妙而严谨：
1. 构建工具细胞
首先，研究者建立了一个源自小鼠非小细胞肺癌（NSCLC）的细胞系（KPD），该细胞系具有特定的致癌背景（KRAS突变，p53和Dicer1缺失），能在免疫缺陷小鼠皮下成瘤，但本身几乎不发生转移，为筛选“转移促进基因”提供理想背景。接着，他们给这个细胞系装备了“基因剪刀”Cas9，并将其与绿色荧光蛋白（GFP）融合，便于追踪。
2. 引入KO文库
选用小鼠全基因组CRISPR敲除文库（mGeCKOa），包含67,405条sgRNA，覆盖20,611个蛋白编码基因和1,175个microRNA前体，同时设置1,000条非靶向sgRNA作为对照。以低MOI（0.4）将mGeCKOa文库转导至Cas9-GFP KPD细胞，确保每个细胞仅整合1条sgRNA，文库覆盖率达400倍以上。
3. 细胞移植
体外培养1周后，将3×10⁷个基因编辑细胞皮下移植至免疫缺陷Nu/Nu小鼠（图1A）。随后，肿瘤开始生长。在这个过程中，携带不同sgRNA（即不同基因突变）的细胞在体内微环境中展开“竞争”。那些携带了能促进生长或转移的突变的细胞，会在肿瘤中占据优势；而携带了不利突变的细胞则会被淘汰。
4. 测序与数据分析
在移植后不同时间点（如2周、6周），分别收集早期原发肿瘤、晚期原发肿瘤以及肺转移灶。从这些组织中提取基因组DNA，通过高通量测序，定量分析每个sgRNA的丰度变化。鉴定富集sgRNA（对应基因敲除后促进肿瘤生长或转移）和耗竭sgRNA（对应基因敲除后抑制肿瘤存活）。
二、核心结果解读：从基因扰动到生命现象的全景描绘
结果一：CRISPR 文库转导显著增强肿瘤转移能力
通过以上方法发现仅携带Cas9的对照组细胞与转导了mGeCKOa文库的实验组细胞在原位都能形成肿瘤，且早期生长速度差异不大。然而，关键的差异出现在远端器官：移植6周后，89%的实验组小鼠（8/9）肺部出现了肉眼可见的转移灶，而所有对照组小鼠（0/3）肺部均无转移（图1D, E）。
这直接证明，在原本不转移的癌细胞中引入广泛的基因失活突变，足以驱动转移的发生。这并非单一基因的作用，而是多种基因功能丧失组合产生的效应，为后续筛选奠定了基础。
结果二：sgRNA 文库在肿瘤演进中呈现动态选择
对文库质粒、移植前细胞、早期原发肿瘤、晚期原发肿瘤、肺转移灶进行sgRNA 深度测序，发现了一个惊人的多样性丧失过程：从包含数万sgRNA的初始文库，到早期肿瘤时仅保留不到一半，再到晚期肿瘤时只剩下数百个，而肺转移灶中通常仅由寥寥数个（甚至1-2个）sgRNA完全主导（图2B, C）。这表明，从原发肿瘤形成到远端转移定植，每一步都存在极其严苛的“选择瓶颈”，只有最具适应性的少数克隆能够胜出。不同阶段样本的sgRNA丰度分布曲线存在显著差异（图2D），进一步印证了强烈的选择压力存在于肿瘤发展的全过程。
结论：肿瘤在体内的生长和转移，是一个伴随着遗传多样性急剧减少的强选择过程。转移并非随机事件，而是由原发肿瘤中已经占据生长优势的特定克隆所驱动。
图2.mGeCKOa文库在肿瘤生长和转移不同阶段的表达
结果三：晚期原发肿瘤中富集凋亡通路相关基因
对晚期原发肿瘤中富集的sgRNA进行分析，发现它们显著富集于凋亡相关通路。多个靶向经典抑癌基因的sgRNA被高频检出，例如 Pten、Cdkn2a（p16）、Cdkn2b（p15）、Nf2 等（图3B, C）。这表明，在原位肿瘤的竞争环境中，逃避细胞凋亡、解除生长抑制是癌细胞获得优势的核心策略。
结论：促进原发性肿瘤快速生长的突变，主要集中在解除内在生长抑制和促凋亡机制的基因上。这些“胜出者”构成了后续可能发生转移的“种子”克隆库。
图3. mGeCKOa筛选原发性肿瘤中富集的sgRNA
结果四：肺转移灶中的“终极赢家”与原发肿瘤高度重叠
分析肺转移灶中的sgRNA组成，发现其与同一小鼠的晚期原发肿瘤高度相似（图4C）。在晚期肿瘤中占主导的sgRNA，通常也在其对应的转移灶中占主导。在多个小鼠中重复出现的转移灶富集sgRNA，指向了一批基因，包括已知抑癌基因（Nf2, Pten, Cdkn2a），以及一些功能未知或与癌症关联较小的基因（如Trim72, Fga）和microRNA（miR-152, miR-345）（图4E, G, H）。有趣的是，一小部分sgRNA在转移灶中的相对丰度甚至超过了在原发肿瘤中的丰度（MPR > 1），例如靶向 Nf2, Trim72 的sgRNA（图4F），暗示这些基因的失活可能对转移的特定步骤（如外渗、定植）有特别强的促进作用。
结论：驱动转移的优势突变，与驱动晚期原发肿瘤生长的突变存在极大的重叠。这支持了“转移能力是癌细胞内在增殖优势的一种延伸”这一观点。同时，也筛选出一批可能特异性调控转移过程的新候选基因。
图4. mGeCKOa筛选肺转移瘤中富集的sgRNA
结果五：单个sgRNA 验证证实核心基因的转移促进作用
为验证筛选获得的候选基因（Nf2、Pten、Trim72 等）是否真的调控肿瘤生长和肺转移，排除文库筛选的假阳性。研究者挑选了8个候选（Nf2, Pten, Trim72, Cdkn2a, Fga, Cryba4, miR-152, miR-345），为每个基因设计多个独立sgRNA，分别转导细胞后移植小鼠。
结果显示，敲除Nf2, Pten, Cdkn2a能极其显著地加速肺转移；敲除Trim72, Fga及两个miRNA也有明显的促转移效果（图5C, D）。更重要的是，这些基因的敲除在促进转移的同时，也大多加速了原发肿瘤的生长（图5E）。并且，单个基因水平上，促转移能力与原发肿瘤生长速度呈强正相关（图5F）。
结论：通过个体验证，确证了全基因组筛选发现的关键基因。这些基因的失活，通过增强原发肿瘤的生长优势，间接但强有力地推动了转移进程。这一发现统一了肿瘤生长与转移在基因层面的调控逻辑。
图5.使用单个sgRNA验证mGeCKOa筛选中的靶基因和microRNAs
结果六：微型库验证确认核心基因的协同转移促进作用
为验证候选基因集合的转移促进效应，分析多个核心基因的竞争动力学，排除单个基因验证的偶然性。研究者构建了一个仅包含524个靶向53个顶级候选基因sgRNA的“验证微型库”，以及一个对照库。
用微型库转导细胞后移植，发现其诱导的肿瘤转移率远高于对照库（图6C），再现了全库表型。测序分析微型库在体内的动态，完美复现了全库实验中的选择模式：从细胞池到晚期肿瘤再到转移灶，sgRNA多样性急剧下降，最终由少数几个基因（如Nf2, Pten）的sgRNA主导（图7A, B, C）。
结论：微型库实验不仅再次验证了关键基因的功能，更重要的是，它在一个可控的简化系统中，生动再现了多个促转移突变在体内相互竞争、最终胜者通吃的进化动力学过程，为理解肿瘤克隆演化提供了直接证据。
图6.移植的Cas9-GFPKPD细胞中肿瘤的演变及微型库表达情况的研究
图7.原发性肿瘤和肺转移瘤的验证微型库筛选富集sgRNAs
三、总结与展望
本研究的全基因组CRISPR 体内筛选研究，不仅揭示肿瘤转移基因调控网络，更建立可复用的体内功能基因组学技术框架。当前 CRISPR 筛选技术普及中，文库构建、体内移植等技术门槛让多数实验室却步。
海星生物基于该研究原理，推出一站式文库体内筛选服务，提供全流程支持。服务复刻并优化核心技术：文库设计上，有全基因组、特定通路定制化sgRNA 文库及非靶向对照；模型构建支持多类小鼠模型与肿瘤移植；检测分析整合多维度手段，还能提供额外基因功能解析信息。
此外，海星生物拓展服务边界，支持CRISPRa 筛选、免疫健全模型筛选等，弥补原研究局限。其还提供标准化服务包与定制方案，模块化流程让更多科研人员借助该技术突破瓶颈。
如今，海星生物等平台让这一前沿技术普及，助力更多疾病机制探索与治疗靶点开发，推动突破性发现与临床转化。
参考文献：Chen S, Sanjana N E, Zheng K, et al. Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis[J]. Cell, 2015, 160(6): 1246-1260.
技术服务CRISPR/Cas9细胞基因编辑、载体构建/文库病毒、分子诊断参考品/突变基因参考品/融合基因参考品、细胞稳转 / 细胞干扰
细胞试剂HyCyte®干细胞/原代细胞/细胞株、三系诱导培养试剂、细胞专用培养基、基因编辑试剂盒、病毒现货、预筛选胎牛血清
