生物组织中的DNA经过怎样的“洗礼”,最终在芯片上被“认可”……
一 测序文库
即DNA片段的一个集合,将DNA序列打断后即构成一个文库(提取出的DNA需经过一系列操作才能用于测序)。
1.打断
DNA打断方式:机械法,超声波法和酶切法。从100k-300kbp到较小片段
超声波法打断可设置打断长度如500bp(base pair碱基对,500为峰值,即大部分在500bp左右),那么这个集合就是500bp的文库,常见的有170bp、350bp。
一般1000bp以下为小片段文库
1000bp以下为大片段文库
2.检测
打断过程中要确保DNA没有降解,需对样品进行检测(电泳)
3.回收
打断后需电泳回收一定范围内片段,如500bp文库可回收300-800bp的片段,文库大小值非常重要,又称为插入片段长度insert size,后续序列拼接和短序列比对时会大量用到
回收完文库,进一步“加工处理”
4.加工
3'端加A碱基—平末端变粘性末端——便于进一步连接引物和接头
加测序引物和index标签(6-8bp碱基片段,用于区分不同测序物种,高通量测序,一个芯片可混合测很多物种,需区分)
加adapter接头分为p5和p7,在序列两端(与芯片互补配对,防止DNA片段被冲走)
PCR扩增
扩展:PCR-free文库:顾名思义,就是不使用PCR扩增而直接构建文库,需要特定的试剂盒,这样的文库免除了因扩增导致的错误,没有偏好性,不过成本相对高一些。
二 测序芯片
外表载玻片,实则黑科技,英文名flowcell,中文名测序芯片
八条通道称为8lane,每条lane上下都有化学修饰,种植了很多引物,与p5 p7 接头连接,保证DNA不被流体冲走
1flow * 8lane * 2surface*3swath*16tile=768个“反应堆”
素材来源于网络~