WB（Western Blotting）原理与步骤

先看看定义：

Western blotting（蛋白质印迹）使用抗体从复杂样品中识别单个蛋白质，并进行半定量分析。首先，通过SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）将蛋白质根据大小分离。接下来，通过施加电流将蛋白质从凝胶转移到膜上。最后，根据特定的抗原-抗体结合，可以通过特异性一抗检测和分析负载了抗原的印迹膜。

蛋白质印迹主要用于：

1.蛋白定性
2.半定量（样本之间的相对定量，比如A是B的多少倍）

基本步骤：

三大流程

Separation - - - - > Transfer - - - -> Detection

1.Separation（分离：加缓冲液并加热至95℃）：

分离用到的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE）是聚丙烯酰胺凝胶电泳中最常用的一种蛋白表达分析技术。

原理：是根据检体中蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳胶中分离。聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应，蛋白质在电场中支持物上的迁移率差异主要依赖于样品中各种分子携带的电荷，分子大小与形状的差别。聚丙烯酰胺凝胶电泳系统加入阴离子去垢剂SDS，蛋白质在加热变性以后与SDS结合，带上负电荷，在电场的作用下，向正极移动，结果按分子量大小排列在胶板上，含量多的蛋白带纹粗，蛋白质的迁移率主要取决于分子量大小。

要加到蛋白质样品里的东西

这些东西包括SDS统称为上样缓冲液，加入上样缓冲液的目的是使你的样品溶液中所有的蛋白质带均匀的负电荷。在蛋白质溶液中，有这些相互作用驱动：

SDS是什么？

SDS

SDS是一种阴离子表面活性剂，在长的疏水性碳链末端含有带负电荷的极性头基。它可以干扰非共价力，也就是氢键、离子键以及疏水相互作用是蛋白质变性。
到此为止蛋白质还没有完全变性，因为还有二硫键没有裂开。emmmm如变对吧。这个时候β-巯基乙醇的作用就出现了，为什么要加β-巯基乙醇？就是因为它可以分解二硫键，从而使蛋白质完完全全地线性化。原理是巯基乙醇【强还原性】可以使二硫键还原成2R-SH，和一个稳定的结构，使化学平衡向右移动。
SDS与蛋白质结合的相当均匀，与SDS贡献的负电荷相比，蛋白质本身的电荷可以忽略不计。

这样，蛋白质就可以根据其分子量的大小从而带有不同的负电荷，如图：

以上种种解释了不同蛋白在聚丙烯酰胺凝胶中分离的原理。

跑完之后把胶的有孔部分剪掉，接着进行下一步。
PS制胶：老实说按照公司给你的制胶流程去做就好了，成份一般见下图

2.Transfer（转模：利用电场作用将蛋白质从凝胶中转移到膜上）：

当进行湿转移时，裁剪完成的胶要先放到Transfer buffer（转移缓冲液）中平衡，便于将其装在印迹缓冲液的托盘中摇晃。

印迹三明治（blotting sandwich）:先将凝胶支架盒浸到转移缓冲液中，黑色面朝下，白色面朝上，然后从缓冲液中取出，然后将纤维泡沫垫浸到转移缓冲液中，然后将其放到凝胶支架盒的黑色面上，然后将一张滤纸浸到转移缓冲液中，然后将其放置到纤维泡沫垫的上面，然后把震荡过后的胶拿过来用吸水纸擦干，然后把胶放到滤纸的上面，转移时，可以使用硝酸纤维素膜（NC）或聚偏二氟乙烯膜(PVDF),将其中一种膜（以PVDF为例）浸到转移缓冲液中，拿出然后将膜再放到胶上面，然后将另外一张滤纸浸到转移缓冲液中，拿出后放到PVDF上，然后将另一个纤维泡沫垫浸到转移缓冲液中，拿出后放到滤纸上面，然后将凝胶固定盒关闭并用夹子锁定。

然后接下来就是凝胶固定盒放到内部模块，内部模块放到大盒子里面，加缓冲液，通电就OK。结果是在电场力的作用下，蛋白片段会从胶转移到PVDF上。然后逐一拆卸装置，把胶取下，胶上的蛋白质电转移后到了PVDF上，下一步就要对PVDF膜进行Detection.

3.Detection（检测）：7.40min

首先把膜浸到含有牛血清白蛋白（BSA）的封闭液中，目的是为了防止膜与要加进来的抗体之间发生相互作用，添加封闭液后，进行孵育（就是放到摇动平台上）。电转移之后的目标蛋白附着在膜上，BSA就附着在膜上没有目标蛋白附着的其他部位。所以添加抗体的时候抗体就只能与目标蛋白发生作用。吸去封闭液，然后加一抗含（有一抗的溶液），轻轻搅拌孵育膜。