先看看定义：
Western blotting（蛋白质印迹）使用抗体从复杂样品中识别单个蛋白质，并进行半定量分析。首先，通过SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）将蛋白质根据大小分离。接下来，通过施加电流将蛋白质从凝胶转移到膜上。最后，根据特定的抗原-抗体结合，可以通过特异性一抗检测和分析负载了抗原的印迹膜。
蛋白质印迹主要用于：
1.蛋白定性
2.半定量（样本之间的相对定量，比如A是B的多少倍）
基本步骤：
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三大流程
Separation - - - - > Transfer - - - -> Detection
三大流程
1.Separation（分离：加缓冲液并加热至95℃）：
分离用到的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE）是聚丙烯酰胺凝胶电泳中最常用的一种蛋白表达分析技术。
要加到蛋白质样品里的东西
SDS
到此为止蛋白质还没有完全变性，因为还有二硫键没有裂开。emmmm如变对吧。这个时候β-巯基乙醇的作用就出现了，为什么要加β-巯基乙醇？就是因为它可以分解二硫键，从而使蛋白质完完全全地线性化。原理是巯基乙醇【强还原性】可以使二硫键还原成2R-SH，和一个稳定的结构，使化学平衡向右移动。
SDS与蛋白质结合的相当均匀，与SDS贡献的负电荷相比，蛋白质本身的电荷可以忽略不计。
以上种种解释了不同蛋白在聚丙烯酰胺凝胶中分离的原理。
跑完之后把胶的有孔部分剪掉，接着进行下一步。
PS制胶：老实说按照公司给你的制胶流程去做就好了，成份一般见下图
2.Transfer（转模：利用电场作用将蛋白质从凝胶中转移到膜上）：
当进行湿转移时，裁剪完成的胶要先放到Transfer buffer（转移缓冲液）中平衡，便于将其装在印迹缓冲液的托盘中摇晃。
然后接下来就是凝胶固定盒放到内部模块，内部模块放到大盒子里面，加缓冲液，通电就OK。结果是在电场力的作用下，蛋白片段会从胶转移到PVDF上。然后逐一拆卸装置，把胶取下，胶上的蛋白质电转移后到了PVDF上，下一步就要对PVDF膜进行Detection.
3.Detection（检测）：7.40min
首先把膜浸到含有牛血清白蛋白（BSA）的封闭液中，目的是为了防止膜与要加进来的抗体之间发生相互作用，添加封闭液后，进行孵育（就是放到摇动平台上）。电转移之后的目标蛋白附着在膜上，BSA就附着在膜上没有目标蛋白附着的其他部位。所以添加抗体的时候抗体就只能与目标蛋白发生作用。吸去封闭液，然后加一抗含（有一抗的溶液），轻轻搅拌孵育膜。
粉色一抗，黄色BSA
蓝橙色是二抗
化学发光蛋白质印迹检测是蛋白质印迹检测上检测蛋白质最常用的方法，为检测目标蛋白质，二抗通常与报告酶（比如辣根过氧化物酶）连接。
为了使蛋白发光：底物通常是鲁米诺，与过氧化氢在辣根过氧化物酶的催化下可以反应发出荧光（荧光是由系反应后的产物释放425nm的光子衰变到较低能状态）。荧光的产生与辣根过氧化物酶与二抗结合的量成正比。
反应前
反应后
参考：
1.华美生物
2.bilibili:western blot原理和过程学习
3.巯基乙醇为什么能破坏二硫键？
4.WB各胶的配置
