自噬在维持抗流感感染免疫记忆中的重要作用
几个世纪以来，疫苗接种一直是预防病毒感染最广泛使用的策略。然而，控制免疫记忆在疫苗应答中的长期持久性的分子机制仍不清楚。记忆B细胞显示基础自噬水平升高，调节自噬起始或自噬体成熟的基因表达增加。B细胞特异性缺失Atg7 (B/Atg7 - / -)的小鼠在流感免疫后显示正常的一抗应答，但在流感病毒攻击时不能产生保护性的二抗应答，导致高病毒载量，广泛的肺破坏和死亡率增加。本文研究结果表明，自噬对于病毒特异性记忆B细胞的存活和抵抗感染所需的保护性抗体反应的维持至关重要。
背景介绍：
在细胞免疫中蛋白类抗原由抗原提呈细胞（APC）处理成多肽，它与MHC结合并移至APC表面，产生活化TCR信号；而抗原与T淋巴细胞表面的有关受体结合就产生第二膜信号，协同刺激信号。在双信号刺激下，T淋巴细胞才能被激活就是Bretcher-Cohn双信号模式。T淋巴细胞被激活后转化为淋巴母细胞，并迅速增殖、分化，其中一部分在中途停下不再分化，成为记忆细胞；另一些细胞则成为致敏的淋巴细胞，其中Tc有杀伤力，使外源细胞破裂而死亡。TH细胞分泌白介素等细胞因子使Tc、 Mφ以及各种有吞噬能力的白细胞集中于外来细胞周围，将外来细胞彻底消灭。在这一反应即将结束时，Ts开始发挥作用，抑制其他淋巴细胞的作用，终止免疫反应。记忆细胞不直接执行效应功能，留待再次遇到相同抗原刺激时，它将更迅速、更强烈地增殖分化为效应细胞，有少数记忆细胞再次分裂为记忆细胞，持久地执行特异性免疫功能。
作者介绍：
结果：
1.在记忆B细胞中细胞程序性死亡减少并形成自噬
作者比较了4-羟基-3-硝基苯乙酰偶联锁眼帽贝血青素(NP-KLH)免疫小鼠抗原特异性GC(生发中心)和记忆B细胞的凋亡信号。IgM−IgD−CD11b−Gr-1−CD138−(DUMP−) B220 +IgG1 +NP+CD38−GC B细胞，而不是DUMP−B220+IgG1+NP+CD38+记忆B细胞，在体外培养后表现出细胞的快速死亡(图1a)。因此，通过细胞内染色，np特异性GC B细胞显示caspase-9和caspase-3的激活，而np特异性记忆B细胞缺乏明显的caspase激活(图1b)。这些数据表明，GC B细胞的记忆B细胞的发育伴随着对细胞死亡的抵抗力增强。
为了研究自噬是否可以保护长寿命的记忆B细胞，作者首先通过检测自噬体形成的标记物微管相关蛋白轻链3 (LC3)的加工形式来测量记忆B细胞的自噬情况，结果如图所示，在记忆B细胞中检测到LC3聚集点，而在GC B细胞中检测不到(图1c)。与naïve B细胞和其他B细胞亚群相比，实时RT-PCR显示，记忆B细胞中自噬起始关键的Ulk1 (Atg1)、Beclin 1 (Atg6)、Rb1cc1、Atg14和Uvrag 的mRNA水平增加了，以及自噬体成熟所需的Atg5、Atg7、Map1lc3a、Map1lc3b和Gabarap 的mRNA水平均显著升高(图1d)。这些结果表明记忆b细胞表现出组成性的活跃自噬。
2.自噬对记忆性B细胞的存活是必需的
为了确定自噬是否在体内保护记忆B细胞，作者通过将CD19-cre小鼠与Atg7 flox小鼠杂交产生了B/Atg7−/−小鼠。Atg7缺乏增加了B1-a细胞的周转率，但在体外和体内均没有增加常规B细胞的周转率(图2a和补充图3a-d)。作者发现NP-和HA-Atg7 - / -记忆B细胞都经历了显著增加的自发细胞死亡，而GC B细胞的细胞死亡不受自噬缺陷的影响(图2a和补充图3e)，这表明自噬保护记忆B细胞免于细胞死亡。
作者发现，在自发性细胞死亡的Atg7 - / -记忆B细胞中，caspase-9或caspase-3没有明显的激活(图2b)，这表明自噬缺陷触发了记忆B细胞中caspase非依赖性细胞死亡。虽然抗原特异性记忆B细胞和GC B细胞通过细胞内染色显示出相似的Bcl-xL和Mcl-1水平，但记忆B细胞表达更多的Bcl-2，而Atg7的缺失并未改变这些Bcl-2家族分子的表达(补充图4)。
3.在没有自噬的情况下，一抗反应正常但二抗反应有缺陷
接下来，作者进一步研究了自噬缺陷是否会影响原代和记忆B细胞反应。NP-KLH免疫后第14天的一抗反应，作者对包括产生高亲和力和总(包括高亲和力和低亲和力)抗-np 的IgG亚类和抗-np 的IgM在B/Atg7 - / -小鼠和对照组中进行了比较(图3a和补充图5a, B)。初次免疫两周后，B/Atg7 - / -小鼠和对照组脾脏或骨髓中np特异性IgM或IgG1 ASC的数量相似(补充图5c)。
在免疫B/Atg7−/−小鼠和对照组中，B220+GL-7+Fas+ or FITC-标记的GC B细胞的诱导效果相当(补充图6b-d)。这些结果表明，B/Atg7 - / -小鼠的早期一抗反应，包括生发中心的形成、亲和成熟和转换，在很大程度上是正常的。免疫后6周，B/Atg7−/−小鼠的抗np IgG1抗体出现中度降低(补充图6e)，这可能是由于缺乏自噬的抗体分泌浆细胞的丢失所致。
与正常的早期一抗反应相比，作者发现B/Atg7−/−小鼠的二抗np IgG1抗体产生严重减少(图3b)。在B/Atg7 - / -小鼠的脾脏和骨髓中，分泌抗np IgG1的ASC数量也严重减少了约10倍(图3c, d)。这表明自噬是T细胞依赖性抗原的二抗反应所必需的。
4.自噬缺乏导致氧化应激升高，脂质过氧化和记忆B细胞丧失
由于B/Atg7 - / -小鼠的二抗反应存在缺陷，作者想进一步确定记忆B细胞的产生或维持是否可能在这些小鼠中存在缺陷。B/Atg7−/−小鼠在免疫8周后显示出np特异性记忆B细胞的严重减少(图4a, B)。B/Atg7−/−小鼠在初次免疫后第1周和第2周产生的np特异性记忆B细胞正常(图4c)。然而，我们在B/Atg7 - / -小鼠中检测到记忆B细胞的快速下降(图4c)。这些数据表明，记忆B细胞最初可以产生，但不能在B/Atg7 - / -小鼠中持续存在，从而为在这些小鼠中观察到的缺陷二抗反应提供了解释。panaspase抑制剂喹酰戊基o -甲基天冬氨酸-[2,6-二氟苯氧基]-甲基酮(qVD-oph)不能维持这些细胞的存活(图4d)。rip1依赖性坏死的抑制剂，包括Nec-1和Nec-5，也没有显示出效果(图4 d)。相反，一种靶向氧化应激的坏死抑制剂NecroX-2显示出对Atg7−/−记忆B细胞死亡的显著抑制(图4d)。此外，ROS清除剂n -乙酰- l-半胱氨酸(NAC)和tempol也能保护Atg7−/−记忆B细胞免于细胞死亡(图4d)。这表明氧化应激介导了自噬记忆缺陷B细胞的细胞死亡。
已知自噬可促进功能失调线粒体的清除，而功能失调的线粒体可产生过量的ROS诱导细胞死亡。免疫细胞化学表明，解偶联剂羰基氰化物对三氟甲氧基苯基腙(FCCP)破坏线粒体膜电位，增加了记忆B细胞中与线粒体共定位的自噬体的数量(图4e)。
5.在体内通过抑制ROS和alox5依赖性脂质过氧化，拯救Atg7−/−记忆B细胞
为了进一步确定ROS的增加是否有助于体内Atg7 - / -记忆B细胞的丧失，作者在免疫后将抗氧化剂NAC注射到B/Atg7 - / -和对照小鼠中。作者观察到，持续给药NAC降低了免疫B/Atg7−/−小鼠记忆B细胞中的ROS水平(图4h)。NAC还部分挽救了B/Atg7 - / -小鼠的记忆B细胞和二抗反应(图4h)，验证了自噬抑制ROS产生在保护记忆B细胞存活中的作用。α-Toc可有效抑制B/Atg7 - / -小鼠记忆B细胞的脂质过氧化(图4i)。α-Toc注射也部分恢复了B/Atg7 - / -小鼠的记忆B细胞和二抗反应(图4i)，表明脂质过氧化升高有助于B/Atg7 - / -小鼠记忆B细胞的丧失。（Alox5是一种主要的脂氧合酶，催化膜脂过氧化，并参与促进细胞死亡）。因此，利用B/Atg7−/−与Alox5−/−小鼠杂交，作者发现，在体外培养过程中，Alox5的额外缺失抑制了Atg7−/−记忆B细胞膜脂过氧化的诱导(图4j)。在B/Atg7 - / -小鼠中，Alox5的缺失也部分挽救了记忆B细胞和二抗反应(图4j和补充图8)。这些结果表明，Alox5依赖的膜脂过氧化参与了自噬缺陷记忆B细胞加速死亡的过程。
6.B/Atg7 - / -小鼠中记忆B细胞对流感病毒的反应受损
作者确定了针对甲型流感病毒的记忆免疫反应是否依赖于自噬。甲型流感感染诱导野生型小鼠脾脏和肺部的流感HA特异性IgG或IgA记忆B细胞(图5a, B)。然而，这些记忆B细胞在B/Atg7 - / -小鼠中显著降低(图5a, B)。在再次感染流感病毒后，B/Atg7 - / -小鼠中二级抗ha IgG或IgA抗体的产生也严重受损(图5c)。此外，B/ Atg7−/−小鼠在再次感染甲型流感后，IgG或IgA ASC显著降低(图5d)。综上所述，这些数据表明，B细胞的自噬对于维持B细胞对流感感染的保护性记忆反应至关重要。
用亚致死剂量的甲型流感病毒免疫后，野生型小鼠在两个月后完全免受病毒的致命再次攻击(图6a)。野生型免疫小鼠也不会出现体重下降(图6b)。相比之下，70%的免疫B/Atg7 - / -小鼠在再次注射致死剂量甲型流感病毒2周后死亡(图6a)。所有免疫的B/Atg7−/−小鼠在流感再次攻击后也表现出明显的体重减轻(图6b)。组织学分析显示，再攻B/Atg7 - / -小鼠肺部存在广泛的肺破坏和白细胞浸润(图6c)。同样，在致死性再激B/Atg7 - / -小鼠的支气管肺泡灌洗液(BAL)中发现大量巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞(图6d)。再感染4天后，免疫B/Atg7 - / -小鼠的肺部病毒滴度比野生型对照高10,000倍(图6e)，表明B/Atg7 - / -小鼠无法有效清除流感病毒。总之，这些数据表明，B/Atg7 - / -小鼠免疫未能诱导保护性体液免疫来控制流感病毒再感染。尽管抗体在抵抗流感感染方面起着重要作用，但T细胞反应也可能具有一定程度的保护作用。再次感染后存活的B/Atg7 - / -小鼠仍然表现出有缺陷的抗ha抗体反应，但显示出增加的T细胞扩增(补充图10c, e)。这些存活的B/Atg7 - / -小鼠中增加的T细胞扩增可能是由于对更高流感病毒载量的代偿性T细胞反应(图10c, e)。
作者接下来确定是否有可能通过促进自噬来改善记忆B细胞反应。雷帕霉素可通过抑制mTOR诱导自噬。作者发现雷帕霉素增加了自噬体的形成，提高了野生型记忆B细胞的存活率(补充图11a-c)。
雷帕霉素还增强了过继转移野生型记忆B细胞保护B/Atg7 - / -小鼠免受流感感染的能力(Supplementary Fig. 11d)，这表明诱导自噬可以促进记忆B细胞的功能。接种疫苗后，促进人类记忆B细胞的自噬，可以提高对流感病毒的保护。
