参考: 从零开始完整学习全基因组测序数据分析：第1节 测序技术

作者：碱基矿工
参考：【陈巍学基因】视频1：Illumina测序化学原理

前言

什么是全基因组测序？

全基因组测序，英文为Whole Genome Sequencing，简称WGS，指的是把物种细胞里面完整的基因序列，从第一个DNA开始，一直到最后一个DNA，完完整整地检测出来，并排列好。

全基因测序的意义？

全基因测序，理论上可以得出基因组上任何类型的突变。包含了所有基因与其的生命特征的关联信息。

测序技术

第一代测序技术

第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法。（Sanger 法）
世界上第一个全基因序列（噬菌体phiX-174），就是由桑格在1977年完成的。

原理

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优点&缺点

优点：测序准确率高，高达99%。
缺点：通量低，成本高。

其他基于相同原理的，还有焦磷酸测序法、连接酶法等。

第二代测序技术（NGS）

我们一般说的NGS（Next Generation Sequencing），或高通量测序技术，都是指第二代测序技术。
按照上面说的一代测序特点，显然是难以进行大规模使用的，也因此并不是一个理想的大规模测序方法。

• （要是用一代测序，做人类基因组计划的方法，需要多久呀？！以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周）

Roche公司的454技术与illumina公司的Solexa/Hiseq技术和ABI公司的SOLID技术的出现，标志着NGS 的诞生。

原理

目前主流的NGS 测序，采用illumina 技术。主要采用一种边合成边测序的方法。除此之外，NGS 的特点还有其序列读长方面短很多。

1）构建DNA测序文库

使用超声波，将一堆DNA分子用超声波打断成一定长度范围的小片段。一般来说，基本都是打断为300bp-800bp长的序列片段，在两头用酶补平。接着在3'端用Klenow 酶加上一个A碱基，然后再用连接酶在小片段A碱基后面加上一段DNA序列（接头）。构建出单链DNA文库，备用。

2）流动槽（flowcell）吸附

flowcell 是用于吸附流动DNA 的槽道，是测序的反应容器。flowcell 一般由八个槽道构成，被称为lane。每个lane 的表面被设计成有很多的接头，而这些接头则可以和建库过程中加在DNA片段两端的接头配对。通常来说lane 上的接头为两种引物，正好配对DNA片段两头添加的接头。
而lane 上的接头，一般也是通过共价键的方式连到flowcell 上。因为后面的步骤会有大量液体流过flowcell，为避免引物被冲掉。
需要⚠️的是，这里lane 的引物一般被设计为一头与DNA 一端互补，一头与DNA 另一端一致。

lane 上的引物

当第一步文库构建完成后，文库中的DNA 在通过flowcell 的时候便会与lane 上的接头配对，并随机吸附在槽道的表面。
理论上lane 之间不会有相互的影响。

3）桥式PCR扩增与变性

本质是将文库种到flowcell 上并进行扩增的过程。
因为文库两头添加的DNA序列与lane 上的接头是互补的，所以当二者结合会产生互补杂交。

将文库加入到flowcell 上。会进行以下步骤。

1.杂交结合。

文库会与表面的引物结合，互补杂交。

2.合成互补链。

杂交后，会往其中加入dNTP 与聚合酶，聚合酶会从引物起始位置开始，合成文库的互补链。

3.解链。

加入NaOH 碱性溶液，DNA 双链此时会发生解链。而此时的模版链（文库），也就是没有与引物结合的链，就被冲走了。

4.重连接。

通过加入中性溶液，缓冲碱性液体。此时引物上的互补链便会和引物上的另外一个引物发生杂交。ps：此时的DNA 片段为测序DNA 片段的互补链。

5.再合成。

再次杂交后，再一次引入dNTP 与聚合酶，以原先的互补链为模版，再次合成出一条新的互补链。

6.再解链。

再次加入碱溶液，这时两条链又会解离开。而由于此时两根链都是公价连接在lane 上，并不会被冲刷走。

7.循环4-6

再次加入中性溶液，两根链又会和其他链杂交。

再次加入酶和dNTP，又会合成。

再次加入碱， 又会分离。循环下去，2**n 指数方式增长lane内合成的DNA链。

• 一个个的DNA双链，是不是和桥一样？

8.拆解双链

完成了桥式PCR 的扩增后，需要将合成的双链，拆分成可以测序的单链。理论上说，是通过化学方法，将一个引物（与lane 连接的接头）上的特定基团切掉，此时再用碱溶液来清洗该芯片。此时碱便可以让其中切除基团的DNA链冲刷掉。

9.连接测序引物

再次加入中性溶液缓冲。并在中性溶液内加入测序引物。接下来就是测序工作了。

4）测序

1.合成测序链

加入带荧光标记的dNTP，且3' 末端被叠氮基堵住。（与Sanger的有点像呢）并加入聚合酶。由于3' 末端被堵住了，所以一个循环只能延长一个碱基。

合成完成后，就用水把多余的dNTP 和酶冲掉。

2.测定碱基类型

放到显微镜下进行激光扫描。因为使用的dNTP，事先已经被荧光标记了，便可以根据其发出来的荧光，判断其碱基类型。由于新合成的碱基与模版链碱基互补，便可反推出模版上的基因类型。

3.切除叠氮基团

完成上面的循环后，接着加入一些化学试剂，把4.1 步中dNTP上的叠氮基团与荧光标记基团切除。此时3' 的羟基暴露出来，便可以继续连接新的dNTP。

4.循环1-3

不断重复加堵住3' 的荧光标记的碱基-测定碱基类型-切除标记...过程。重复上百次。

5.读取Index(Barcode)

测得了DNA序列，由于二代测序技术首先是将DNA打断为小片段的，因此便需要判断出测定结果的来源。
文库的接头上，在开始时1）做了一些标记，每一个样本有其特定的接头，每个接头里有一个特定的序列。这段特定的序列，便是index，或barcode。标记了样本的来源。

首先用碱将测完的序列（称为“read1”序列）解链洗脱掉。

接着加入中性液缓冲，然后加入新的测序引物（“read2”序列）。
一般来说，read2测序引物的结合位点，正好在index 序列的旁边。

接下来进行第二轮测序。一般是读6-8个碱基（方法同先前的4.4中的循环）。根据读出来的碱基，便可以判断出它来自于哪个原始样本。

双端测序技术

illumina 测序还应用了双端测序技术。允许从正向和反向读取DNA链，便将illumina 测序的有效长度加了一倍。
除此之外，flowcell 上的8个lane 上，可以有上亿个点提供DNA链的合成，每个类型（来源）的DNA链可以形成一个cluster，而每一个cluster，都是由一样的DNA 链构成。
而上亿个彼此不同的cluster，便实现了很高的测序数据量。（同时对不同的DNA序列进行上述1-4步骤）

优点&缺点

优点：高通量，成本低。
缺点：错误率相比Sanger 法高，主要来源是碱基替换过程可能会出错。（4.1 合成测序链）

• 不同测序仪比较

  
  

第三代测序技术

第三代测序，最大的特点就是实现了单分子测序，因此也被叫做单分子测序。以以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies的纳米孔单分子测序为代表。
而正因其是单分子测序，因此测序过程也无需进行PCR扩增，可以实现超长读长。

PacBio SMRT 测序原理

SMRT 本质也是采用了边合成边测序的思想，以SMRT 芯片（flowcell）为载体进行测序。
首先在flowcell 中添加聚合酶和荧光标记的dNTP。而在碱基配对结合时，SMRT芯片 会利用ZMW（零模波导孔）原理 将反应信号与周围碱基的荧光背景区分，并捕获配对的碱基信号，根据该信号（光的波长与峰值）判断碱基类型。
SMRT 测序中，DNA聚合酶是实现超长读取测序信息的关键。酶的活性越强，其合成时间越长，能够读取到的DNA片段信息就越长。而用于检测的激光则会对酶造成一定的损伤。

零模波导孔原理

在一个SMRT芯片反应管中（SMRTcell），有许多圆形纳米小孔，外径100多纳米，小于几百纳米的检测光的波长。因此能量并不会辐射到周围，而是保持直线状态，起到了保护的作用。
正因此，检测激光从底部打入SMRTcell 后不会穿透小孔进入上方的溶液区，能量会被限制在一个小范围，正好足够覆盖需要检测的部分。
而信号仅仅只是来自于这个小反应区域，孔外背景中其他的dNTP 依然在黑暗中，从而实现降低背景噪音的目的。

甲基化检测

SMRT 技术不仅能够通过信号进行单分子测序，还可以通过检测相邻碱基的测序时间，从而判断出碱基的表观修饰情况，如甲基化等。
若碱基存在甲基化修饰，则其通过DNA 聚合酶的时间会延长，信号中相邻两峰之间的距离会增大，因此可以借助该时间差异进行判断。

优点&缺点

优点：快！检测速度可达到 10 dNTP/s。单分子测序，超长读取。
缺点：错误率高（单分子测序通病），可达到10%-15%，主要是序列缺失及错位。但可以通过多次测序进行弥补。

Oxford Nanopore 测序技术

由Oxford Nanopore 研发的MinION，由于精巧的体积，被俗称为U盘测序仪。

测序原理

与其他测序技术，包括一代、二代及SMRT 测序技术都不相同的是，minION 采用了电信号技术而非光信号对碱基进行测序。
该测序仪中有一种特殊的纳米孔，而孔内则共价结合了分子接头。
当DNA分子通过纳米孔时，这些分子使纳米孔内的电荷发生变化，从而短暂的影响流过纳米孔的电荷强度。
而不同碱基所影响电流的幅度又是有差异的，通过高灵敏度的检测设备，可以检测到这些细微变化，从而坚定出通过的碱基类型。

甲基化检测

和SWRT 芯片一样，minION 也可以读出甲基化的胞嘧啶。

优点&缺点

优点：读长更长，甚至优于SMRT，在几十到上百kb，甚至可以达到900kb。数据可以实时读取，且起始DNA 在测序中不会被破坏。
缺点：依旧是错误率高。