本文选自Developmental Cell，https://doi.org/10.1016/j.devcel.2019.04.011，喜欢的朋友可以自行下载阅读。

大神的综述，赶紧膜拜一下。David Lyden

摘要：转移是肿瘤发展的关键阶段，是治疗癌症的主要挑战，也是癌症死亡的主要原因。原发性肿瘤细胞与远处器官微环境之间通过胞外小泡（胞外小体和微泡）进行细胞间通讯是转移前生态位（PMN）形成和转移的关键。在此，我们综述了外泌体在肿瘤进展中的作用，外泌体在PMN建立中的作用，以及外泌体在器官向性转移中的作用。我们也描述了外泌体的临床应用。

背景：外泌体是由大多数细胞分泌的纳米大小的囊泡（直径30-150纳米）。它们被脂质双层包围，携带各种生物分子，包括蛋白质、聚糖、脂类、代谢物、RNA和DNA。当外泌体被其他细胞吸收时，这些物质被转移并影响受体细胞的表型。因此，外泌体被认为是细胞-细胞通讯的重要介质。外体生物发生起源于内吞途径。它开始于内胚体限制膜的内陷，导致内囊泡的形成。这个被称为多泡体（MVB）的小室与质膜融合，最终以胞外体的形式释放ilv。外泌体的形成需要细胞内多个蛋白质网络的协同作用。其中包括（1）Rab-GTPase蛋白，控制内质体运输；（2）转运所需的内体分选复合物（ESCRT），它由调节ILV形成的多种蛋白复合物组成；（3）四肽是一种跨膜蛋白，可诱导膜曲率，从而形成囊泡；以及（4）各种脂类修饰酶，例如产生促进小泡形成的神经酰胺。值得注意的是，这些因素中的许多直接与外泌体物质相互作用，这表明囊泡的形成是一个复杂的调节过程，它与决定用于外体分泌的底物的选择性隔离紧密相关。除了经典描述的外泌体，外显体群体中也存在异质性，亚群可分为三类：Exo-Large (90–120 nm), Exo-Small (60–80 nm), and the membrane-less exomere(<50nm)。每一个亚型在其大分子组成方面都表现出独特的特性，进一步突出了外泌体生物发生机制的特异性和选择性。由于外泌体不是膜结合的，因此更像是粒子而不是囊泡，因此可以认为外泌体不仅包括小的细胞外囊泡（EV），而且还包括其他细胞内衍生的蛋白质、核酸和脂质的分泌复合物。

除了外泌体，细胞产生其他类型的ev，包括通过直接质膜芽生形成的微泡（mv），被认为比胞外体大，大小从100到1000nm不等。因此，外泌体和MVs之间的两个重要区别包括生物发生的位置和大小。和叶绿体一样，MVs携带多种生物活性因子，包括蛋白质和核酸。MV芽接的初始过程依赖于肌动蛋白聚合，发生在富含神经酰胺、胆固醇和细胞外磷脂酰丝氨酸的质膜脂质域，这些区域共同促进了膜的弯曲和出芽。MVs从细胞表面的断开受小GTPase ADP核糖基化因子6（ARF6）诱导的肌球蛋白收缩性调节，并且ESCRT也参与了MV脱落的最后阶段。ARF6还可以在外泌体生物发生过程中调节ILV萌生到MVBs中。因此，除了目前定义的细胞起源、大小和生物发生的特定方面的区别外，MV形成和外泌体生物发生还采用了常见的蛋白质机制。

细胞间通讯是肿瘤进展和转移的重要特征。值得注意的是，除了原发性肿瘤微环境中的局部信号外，肿瘤还可以远距离向未来转移的部位发出信号，以促进形成一个适宜的、转移前的生态位（PMN），在肿瘤细胞到达后促进其生长。由于外泌体可以运输和转移生物活性分子，因此外泌体在调节转移方面的能力目前受到极大关注。事实上，通过耗尽肿瘤细胞中的Rab27a或药物抑制未来转移部位的外体摄取而减少外泌体分泌足以损害PMN的形成以及肿瘤转移的发生。

值得注意的是，MVs在癌症期间参与细胞串扰；最早的研究之一描述了来自转移性黑色素瘤细胞的MVs如何增强侵袭性较弱的非转移性黑色素瘤细胞的肺定植。关于MVs的进一步研究主要强调了MVs支持原发性肿瘤生长和生存的能力。在这里，我们把重点放在外泌体上，因为根据其历史定义的大小标准和细胞起源，以及它们包括不是真正的囊泡的分泌颗粒，它们被描述为在PMN形成和转移过程中介导长程信号的主要EV群体。我们回顾了外泌体在肿瘤转移中的作用的研究进展，重点介绍了外泌体在肿瘤转移中的作用，外泌体在PMN形成中的作用，以及外泌体的临床应用

外泌体内的肿瘤信息。

包裹中的蛋白质

癌细胞外泌体包含多种蛋白质，有些在不同的细胞类型之间共享，而另一些则是独特的包装，反映了原始细胞。肿瘤外泌体表达一系列蛋白质，包括致癌蛋白、整合素和信号分子。对癌细胞外泌体的分析发现，蛋白质的外体包装在不同的癌症类型之间以及不同转移潜能但来源相似的癌症之间存在差异。来自美国国家癌症研究所（NCI-60）的代表9种不同癌症类型的60种癌细胞系的EV的蛋白质组学特征发现，这些癌症的EV中只有213种蛋白质是共享的，而总体而言，超过6000种蛋白质是唯一的。共有的蛋白质代表了参与生物发生的因素，而独特的蛋白质则反映了细胞的起源，而这些细胞又是潜在的标记物。其他研究对胰腺癌（PaC）进行了全面的蛋白质组学分析外泌体。外泌体的特征从人PaC和非恶性胰腺上皮细胞系的蛋白质组中发现362种蛋白在PaC外泌体中特异表达，已知其在PMN调节和肿瘤细胞增殖、侵袭和转移中的作用。同样，在两个具有不同转移潜能的PaC细胞系的外泌体中发现了4000多个蛋白表达。然而，其中79种差异表达，在更高转移性细胞系的外泌体中发现的蛋白质在粘附、侵袭、生长、代谢和转移中发挥作用。同样，转移性小鼠黑色素瘤细胞系B16F10的外泌体与侵袭性较小的小鼠黑色素瘤变体B16F1相比，具有更高的cMet水平。在这些研究中，来自更具侵袭性的细胞系的外泌体比来自转移性较小的变体的外泌体更具转移性，提示这些独特的外体蛋白表达模式影响转移的进展。

差异和选择性的蛋白质包装也发生在不同来源的癌症和具有特定转移倾向的癌症之间。不同类型肿瘤外泌体中不同整合素的包装对决定携带肿瘤外泌体的器官有一定作用。a6b4和a6b1整合素在转移到肺的乳腺癌（BC）外泌体中最为丰富，而avb5整合素在肝转移（肝向）PaC外泌体中富集。有趣的是，这种外泌体整合素表达模式并不代表细胞整合素的表达，这表明特定的包装途径促进了这些整合素优先排序为外泌体。具体来说，a6b4在肺转移细胞的外泌体中的表达高于细胞本身的表达水平。此外，尽管肝转移细胞的a6b4表达高于肺转移细胞，但来自肺嗜性细胞的外泌体比来自嗜肝细胞的外泌体包裹更多的a6b4。这些外泌体显示的摄取模式反映了肿瘤细胞的转移性器官向性，并依赖于这些整合素，这表明肿瘤分泌的外泌体整合素在决定肿瘤转移的部位起着至关重要的作用，它们可以作为预测器官向性转移的生物标志物。同样，在胃癌（GC）中，整合素avb6通过外泌体在肿瘤细胞之间转移，增强受体细胞的粘附和迁移。此外，在前列腺癌患者中，整合素avb6在外周血单个核细胞中高表达。avb6整合素抑制肿瘤细胞及其外泌体的STAT1/MX1/2信号转导，当通过外泌体转移时，重组单核细胞为M2肿瘤支持表型。

在肿瘤细胞上表达的表皮生长因子受体（EGFR）在肿瘤的发生中起着重要作用，而EVs介导的EGFR信号也被描述为支持肿瘤的进展和转移。早期关于分泌型EGFR在原发性肿瘤发生过程中的作用的研究表明，肿瘤细胞源性MVs向其他肿瘤细胞或内皮细胞（ECs）水平转移癌基因EGFR可促进胶质瘤中癌细胞的生长和存活以及诱导人鳞状细胞癌血管生成。GC外泌体也表达功能活性的EGFR，可以被传递到肝间质细胞的质膜上。EGFR从细胞膜转位，激活HGF，HGF与癌细胞上的cMet结合，促进转移细胞的种植和增殖。EGFR配体也可以通过外泌体转移，促进转移。Amphiregulin是一种EGFR配体，在人类BC和结肠癌（CoC）外泌体中被发现，并增加了周围癌细胞的侵袭性。在CoC中，EGFR和Amphiregulin均在患者血浆外显体中表达。

podoplanin（PDPN）是一种跨膜糖蛋白，在肿瘤组织中表达增高。表达高PDPN的细胞分泌更多的外泌体，这些外泌体包含与细胞粘附、细胞骨架重塑、信号转导、细胞内转运和EV生物发生有关的蛋白质。PDPN本身在外泌体膜上表达，提示糖蛋白在调节外泌体生物发生和货物选择中有着重要但鲜为人知的作用。

一些细胞的外泌体亚群之间的异质性也显示出来。Exo-Large (90–120 nm), Exo-Small (60–80 nm), and the membrane-less exomere(<50nm)三个亚群分别选择性地包装了与不同细胞途径和不同细胞器相关的独特蛋白质。当外谜体显著富含与代谢和聚糖生物学相关的蛋白质时，较大的外显子高度表达annexins、ESCRTs、integrins和信号通路分子。对外泌体释放和支持原发性肿瘤生长和转移至关重要的Rab蛋白主要在外泌体大和外泌体小表达，而不是membrane-less exomere。这些蛋白质表达模式表明，每种亚型在癌症中都有不同的作用。

Nucleic Acid Parcels

外泌体也含有多种rna。大多数研究表明，microRNAs（miRs）和非编码RNAs是外泌体运输的主要RNA物种；然而，也有报告称存在mRNA、rRNA和tRNA。不同的外泌体亚群含有不同数量的RNA，但一般来说，较大的囊泡含有更多的RNA。外泌体RNA介导细胞间的通讯，包括在肿瘤微环境中培养不同的细胞，并显示其作为癌症生物标记物的潜力（表1）。例如，在PrC，外源性miRs诱导成纤维细胞活化、迁移、血管生成和成骨细胞分化，从而促进骨PMN。来自CoC细胞的外体miR-1245通过高转化生长因子b（TGF-b）表达将巨噬细胞重编程为肿瘤相关巨噬细胞（TAM），从而促进肿瘤生长和转移。外泌体miRs也促进了转移生态位（MN）。在大脑中，星形胶质细胞的外泌体将miR-19a转移到BC细胞，导致PTEN表达减少，从而导致CCL2的分泌和髓样细胞的募集，增强增殖，最终增加脑转移。这些研究阐明了外源性miRs在调节癌症进展中的不同作用。

虽然外体miRs的研究最好，但其他外体rna的功能也受到了质疑。卵巢癌（OvC）外泌体向间皮细胞转移MMP1 mRNA在体外和体内诱导腹膜间皮屏障的破坏并促进癌症扩散。另一种RNA损伤相关分子模式（DAMP）转移的机制最近被揭示。在非病理条件下，RN7SL1在成纤维细胞胞浆中被三结合蛋白SRP9/14屏蔽。然而，在BC中，肿瘤细胞激活了癌成纤维细胞的Notch-Myc通路，在外泌体中部署了非屏蔽的RN7SL1。非屏蔽的RN7SL1激活RIG-I，在转移到免疫细胞时产生炎症反应，当转移到BC细胞时诱导肿瘤生长和侵袭。

通过外泌体转移RNA也可以从癌细胞中去除肿瘤抑制分子。在CoC中，肿瘤抑制mir被高度包装成外泌体，而致癌mir在细胞中的表达高于外泌体。外显子介导的细胞miR再平衡有利于原发性肿瘤的进展。

DNA首先在外泌体中被发现为单链DNA（ssDNA）。后来，双链DNA（dsDNA）被发现是外泌体中DNA的主要形式位于囊泡的表面和内部。外体DNA（exoDNA）来源于细胞核和线粒体（mtDNA），代表整个基因组，不偏向特定序列或DNA结构。与非癌细胞的外泌体相比，癌源性外泌体的DNA包装显著更高。此外，在所有外泌体亚群中都发现了DNA，但不同癌细胞系之间的分布有所不同。虽然外泌体DNA包装的机制尚不明确，但有研究表明，小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）利用外泌体去除多余的细胞质DNA（cytDNA），这可能会导致细胞周期停滞或凋亡等衰老。鉴于高水平的基因组不稳定性和cytDNA在癌细胞中的积累，癌细胞可能分泌更多的外泌体DNA以防止衰老和凋亡，确保其生存和增殖潜力。

虽然，很明显癌源性外泌体含有更多的DNA，但是外泌体DNA摄取的功能效应尚不清楚。肿瘤源性外泌体DNA的作用主要是在化疗或放疗的背景下研究的。例如，用拓扑替康或辐射诱导的免疫刺激性DNA分泌治疗患有BC肿瘤的小鼠，通过促进树突状细胞（DC）成熟和CD8+T细胞活化而导致抗肿瘤反应。此外，用伊立替康处理CoC细胞后，可诱导含DNA外泌体的释放。当该外显DNA被肠道固有免疫细胞摄取后，激活炎症小体，诱导IL-1b和IL-18分泌，并产生严重的胃肠道毒性。最后，许多癌症的特征是线粒体DNA的丢失，导致对无氧代谢和休眠的依赖性增加。在激素治疗敏感的BC模型中，癌相关成纤维细胞（CAFs）在其外泌体中包装了大量的mtDNA。获得这种mtDNA的休眠癌干细胞（CSCs）退出代谢停滞，并有助于转化为激素治疗耐药疾病。

如前所述，外泌体DNA代表整个基因组；因此，任何突变都可能在外谜体DNA中发现。因此，从患者血浆中提取的外泌体DNA可用于癌症特异性突变的早期检测。事实上，一些报告显示PaC循环的外泌体可以作为KRAS和TP53等基因中癌症突变的液体活检。此外，外泌体DNA突变频率和预后不良相关

外泌体塑造PMNs：从基础到最终构建

PMN是由远处器官发生的变化引起的，这些变化是为循环肿瘤细胞（ctc）的种植和生长准备的。在PMN模型中，关于转移病灶生长的器官的决定不是随机的，而是由原发性肿瘤分泌因子启动和协调的预定过程。此外，最近的数学模型表明，有两个因素对PMN的形成和转移至关重要：（1）促进转移突变的发生；（2）适宜的环境。没有后者，入侵是不可能的，因为竞争性淘汰和缺乏潜在的生态位。

共同构成肿瘤的分泌因子和分泌因子。这些分泌因子以特定器官为靶点，诱导改变，为ctc创造一个良好的环境。虽然没有直接比较每种因素的相对贡献，但在小鼠黑色素瘤和大鼠PaC已经证明用从这些细胞的条件培养基中分离出的外泌体进行体内治疗足以重现条件培养基处理观察到的PMN诱导。在这里，我们特别关注外泌体如何调控信息，但我们指导读者阅读其他关于PMN形成的评论，这些评论涵盖了在此过程中额外分泌因子的重要作用。对于未来的工作来说，更好地剖析肿瘤分泌组分是如何协同调节PMN的，这无疑是至关重要的。这些PMN变化包括血栓形成、血管渗漏、骨髓免疫细胞浸润、细胞外基质（ECM）和基质调节。

血栓形成：血凝块变厚

癌症患者发生血栓的风险增加，这是预后不良的主要原因。第一个证据表明，在豚鼠肝癌细胞系和小鼠BC细胞系脱落的微粒中，促凝活性得到证实。从那时起，一些研究表明，肿瘤衍生的EVs表现出促凝特性，这可能有助于肿瘤相关血栓形成，而血栓形成往往与转移相关。组织因子（TF）是一种跨膜受体，也是凝血的起始因子，在肿瘤源性外泌体和MVs中的富集与血栓形成的增加有关。TF结合凝血蛋白，引发一系列事件，导致纤维蛋白凝块的形成和血小板活化。在MDA-MB-231bc模型中，与来自非转移MCF7-BC细胞的EVs相比，外泌体和MVs在TF中富集并加速凝血，这表明TF相关的侵袭性表型。通过MDA-MB-231MVs将TF转移到MCF7细胞显著提高MCF7细胞中的TF活性。MDA-MB-231外泌体通过TF依赖性凝血酶的生成促进血浆凝血和间接血小板聚集，但它们也直接与血小板相互作用并独立于TF激活血小板。此外，来自髓母细胞瘤细胞系和儿童胚胎性脑肿瘤的miR-520外泌体直接靶向并降低TF，减少纤维蛋白凝块。

外泌体也通过其他因素或间接影响凝血而诱发血栓形成。黑色素瘤外泌体和MVs富含组蛋白和热休克蛋白，可增强血小板血浆中凝血酶的生成。活化血小板MVs（PMVs）还通过促进MAPK和PI3K-Akt信号传导，支持癌细胞向肺癌细胞转移后的增殖和转移，MMP表达上调，癌细胞粘附到内皮细胞和纤维蛋白原，表明这些凝血相关的途径也支持癌症进展的其他方面。事实上，用肝素（一种抗凝药物）反复治疗口腔鳞癌细胞，可抑制体泌外转移表型并降低体内肿瘤生长。此外，外泌体诱导中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的形成，这一过程增强了癌症相关的血栓形成。net诱导血小板聚集和凝血抑制剂降解。在体内，表达TF的4T1小鼠BC外泌体诱导NET形成和加速血栓形成。在4T1荷瘤动物中观察到类似的NET诱导和血栓形成，这表明外泌体是参与NET依赖性血栓形成的一个关键的肿瘤诱导因子。

血管破裂和渗漏

血管内皮细胞层为液体、蛋白质和细胞提供了物理屏障。内皮细胞之间通过粘附物和紧密连接连接连接，而这些连接又保持内皮屏障功能。评估远处组织发现，癌细胞分泌的可溶性因子和外泌体能够损伤EC连接，这反过来又导致血管通透性增加，使囊泡和细胞进一步进入组织实质。在BC中，多个研究表明外源性miRs诱导血管通透性。MiR-939在bc患者肿瘤中高表达，并通过外泌体转移到ECs，导致血管内皮（VE）-钙粘蛋白（EC特异性粘附蛋白）下调，增加体外血管通透性。在小鼠体内，miR-181c通过下调肌动蛋白调节因子PDPK1，破坏血脑屏障（BBB）的稳定性，导致ECs中肌动蛋白定位异常。这扰乱了肌动蛋白与紧密连接蛋白的结合，增加了血管通透性和脑转移。同样，外泌体miR105通过下调另一种紧密连接蛋白ZO-1，诱导肺和肝血管渗漏，促进转移，从而破坏紧密连接。MiR-105在转移前阶段的患者循环中检测到，血液和肿瘤中的MiR-105水平与BC早期的转移进展相关。在多形性胶质母细胞瘤（GBM）患者中，来自GBM干细胞样细胞的外泌体含有高水平的功能性VEGF-A，可在体外诱导脑内皮细胞的血管生成和通透性。总的来说，这些研究展示了外泌体是如何利用各种机制促进不同癌症转移部位的血管渗漏。

免疫功能阻滞

由自然杀伤细胞（NK）和T细胞等免疫细胞介导的抗肿瘤免疫是一种天然的抗肿瘤免疫。为了克服这一障碍，肿瘤细胞在转移部位参与免疫抑制机制，包括招募其他免疫细胞来抑制这些抗肿瘤反应。免疫细胞的募集是PMN建立的一个标志，这些细胞已经被证明具有免疫抑制能力。尤其是，PMN形成的一个关键始发事件涉及骨髓中造血干细胞和祖细胞的扩张以及这些细胞动员到PMN，在PMN中，这些细胞被重新编程为免疫抑制性髓系，从而阻断T细胞介导的抗肿瘤免疫。有趣的是，外泌体诱导骨髓源性细胞（BMDC）向肺中性粒细胞（PMN）募集，它们还促进骨髓源性抑制细胞的积聚，并直接抑制缺乏肿瘤小鼠肺和肝脏中的T细胞和NK细胞。成熟的树突状细胞也通过呈递肿瘤抗原在抗肿瘤免疫中发挥重要作用，但黑色素瘤衍生的外泌体损害淋巴结（LNs）中的DC成熟。由于淋巴结转移是黑色素瘤向全身转移疾病发展的关键，这些结果说明了外泌体介导的免疫抑制在转移过程中的重要性。

分子水平上，外泌体介导的免疫调节机制多种多样。B16F10黑色素瘤外泌体将活化的cMet转移至BMDC，以促进促转移表型并动员PMN。黑色素瘤外泌体还通过外泌体PD-L1介导免疫抑制，抑制CD8+T细胞功能，促进肿瘤生长。重要的是，循环外泌体PD-L1水平与黑色素瘤患者的转移呈正相关，这表明外泌体介导的免疫抑制机制在促进转移中起着重要作用。B16F10黑色素瘤外泌体含有小核RNA，可激活肺上皮细胞中TLR3的表达，这对于中性粒细胞募集到肺中形成PMN至关重要。在GC模型中，表达高迁移率族盒-1（HMGB1）的外泌体通过与中性粒细胞TLR4受体结合来激活中性粒细胞。虽然中性粒细胞活化对中性粒细胞形成的影响在本研究中没有被研究，但这些中性粒细胞也可能影响中性粒细胞，如黑色素瘤。在PaC模型中，外泌体压迫任何肿瘤-特异性抗原这些外泌体结合自身抗体进入血浆，形成补体机制的诱饵，并阻止针对癌细胞自身的免疫反应。相反，来自非转移性癌细胞的胞外泌体促进TRAIL阳性肿瘤反应性巨噬细胞的扩张、募集和分化，这些巨噬细胞杀死并吞噬肿瘤细胞，有助于减少转移。

Educating the Neighborhood

当肿瘤形成时，它们通过可溶性因子、外泌体和直接的细胞-细胞相互作用来改变间质。此外，远端器官中的bmdc和成纤维细胞是原发性肿瘤外泌体的共同靶点。除了促进成纤维细胞活化，外泌体还通过体外对人成纤维细胞进行代谢重编程，诱导细胞外酸化，这是PMN建立的重要步骤。多发性骨髓瘤（MM）细胞修饰bmdc以创造肿瘤支持环境。然后，修饰的BMDC分泌外泌体，诱导MM肿瘤生长并促进肿瘤细胞的扩散。同样，来自BMDC外泌体的miR-221促进GC细胞迁移、侵袭和基质粘附。黑色素瘤外泌体增强自身的摄取。原发性肿瘤CAFs的外泌体也影响转移。在BC模型中，CAF外泌体增加癌细胞的运动性、迁移性和侵袭性，这依赖于Wnt信号。此外，CAF来源的miRs外泌体的转移促进了BC细胞的非锚定细胞生长、侵袭性和骨转移。

细胞外基质改变

在PMN建立过程中，ECM通过重组已有的分子或通过新的ECM沉积而改变。这些变化受到许多因素的推动，包括可溶性因子、免疫细胞和外泌体，从而为CTC的播种和生长创造了一个宽松的环境。癌源性外泌体调控ECM，外泌体诱导的肝、肺中性粒细胞纤维结合蛋白沉积被描述。在肝脏中，携带巨噬细胞移动抑制因子（MIF）的PaC外泌体促进Kupffer细胞分泌TGF-b，从而诱导星状细胞产生纤维连接蛋白。同样，肺成纤维细胞摄取BC外泌体促进其活化和纤维结合蛋白分泌。此外，外泌体小核RNA增强了肺pmn中MMP9和纤维连接蛋白的表达，从而促进中性粒细胞的募集。在大鼠PaC模型中，由于细胞外基质降解缺陷，外泌体中CD151和Tspan8（属于四斯潘蛋白家族）的耗竭会削弱外泌体介导的PMN形成，从而导致转移减少。暴露于缺氧条件下的PrC细胞分泌富含细胞-细胞连接重构酶的外泌体，导致这些外泌体靶向的PrC细胞的运动性、侵袭性和干性增加。来自高转移性卵巢癌细胞的EVs携带MMP1 mRNA，转移到间皮细胞，MMP1的表达和分泌反过来上调以促进癌症的进展。最后，非小细胞肺癌（NSCLC）细胞调节胞外泌体中podocalyxin的表达，进而影响成纤维细胞中整合素的运输，并通过引入促肿瘤的ECM成分创造一个支持肿瘤细胞迁移和侵袭的微环境。

器官转移之谜

尽管提出了器官靶向性的概念，描述了某些肿瘤转移到特定器官的倾向，最初是由斯蒂芬·佩吉特在120多年前提出的，但转移的这一方面的机制仍不清楚。最近关于外泌体介导的转移的研究部分地解决了这个谜团。肿瘤源性外泌体表达特定整合素模式，即a6b1、a6b4、avb5和avb3，与ECM分子（如层粘连蛋白和纤维连接蛋白）以及靶器官中的某些细胞类型有关，部分决定了肺、肝和脑器官变性部位的未来PMN。此外，在囊泡表面发现的额外外泌体粘附分子和其他外泌体成分，如脂质，也可能介导外泌体在未来转移部位的选择性粘附和细胞融合，从而促进器官向性。关于外泌体在促进转移中的作用的研究也表明，并非所有的小生境都是一样的，肺、肝、骨和LN-pmn表现出独特的特征。关键的是，在体内观察到了EVs从肿瘤转移到转移部位（如肺和LN）的系统性转移，这为肿瘤衍生EVs长距离发出信号的能力提供了直接证据。外泌体诱导远处、未来转移部位微环境发生明显变化的能力证实了它们在调节器官向性转移中的作用。

肺、肝、骨和脑：固定的niche

对肺转移的研究阐明了外泌体介导的PMN形成的定义原则，包括免疫细胞的招募、常驻细胞的培养和间质的改变。对PMN形成的初步描述表明，表达血管内皮生长因子受体1（VEGFR1）的bmdc在癌细胞到达之前就已经回到肺部。这些细胞与局部间质相互作用，并为将来的转移细胞产生接受位点。后续研究表明，原发性肿瘤驱动的外泌体是这一过程的关键介体。表达cMet的黑色素瘤外泌体被bmdc直接吸收，促进其向肺部的浸润，从而形成以血管渗漏为特征的PMN并促进转移。除了迁移性免疫细胞募集到肺部外，外泌体直接靶向肺部以诱导BC模型中的血管渗漏，并调节BC和黑色素瘤中的常驻肺成纤维细胞和上皮细胞。这种外泌体的摄取需要在外泌体中表达层粘连蛋白结合整合素a6b4和a6b1，并且外泌体a6b4还通过促进S100基因表达和Src信号通路支持成纤维细胞活化。在上皮细胞中，黑色素瘤外泌体携带的小核RNA激活TLR3受体，导致向肺PMN募集促转移中性粒细胞。其他研究表明，BC外泌体靶向ECs和下调的细胞-细胞连接蛋白，以促进血管渗漏。BC外泌体Annexin II（AnxII）上调肺间质中pSTAT3和p38MAPK-NF-kB信号通路也与肺转移增强有关。总之，这些关于肺PMN形成的研究表明，外泌体通过靶向不同的细胞类型，诱导多个间质修饰，激活各种促转移的信号传导过程来诱导PMN，所有这些都结合起来创造一个有利于肿瘤细胞定植的环境。

肝转移比原发性肝癌更常见，在许多类型的癌症中都有发现，尤其是胃肠道、乳腺、肺和胰腺，并且与生存率低有关。与肺PMN形成不同，表达整合素avb5的PaC外泌体通过与肝脏中富含纤维连接蛋白的ECM结合而促进肝器官向性，主要由成熟的驻留巨噬细胞（称为Kupffer细胞）摄取，以促进肝转移。Kupffer细胞的这种外泌体摄取通过随后激活肝星状细胞导致肝转移增强，后者分泌纤维连接蛋白以促进BM源性巨噬细胞的募集，并且需要外泌体MIF参与。额外的研究支持了这些发现，证明PaC外泌体不仅被Kupffer细胞所占据，而且还存在于其他巨噬细胞群中，这些巨噬细胞群组织成转移前簇并促进转移。类似地，巨噬细胞携带miR-21的外泌体与TLR7结合并诱导肝巨噬细胞极化。活化的巨噬细胞随后分泌炎性细胞因子，如IL-6和S100A家族成员，支持肝转移。我们目前对肝脏PMN形成的理解强调巨噬细胞是负责接收和传递肿瘤外泌体信息以促进肝器官向性转移的关键角色。

骨是许多实体瘤的首选转移部位，发生在癌症的晚期。而在肺转移和肝转移中，外泌体通过免疫细胞和基质细胞发挥作用；在骨中，外泌体主要调节局部基质细胞、破骨细胞和成骨细胞。骨转移性病变分为溶骨性病变和成骨细胞性病变，前者可导致骨破坏，后者可增加骨产量。它们也可能是由于破骨细胞和成骨细胞功能之间的平衡失调造成的。非小细胞肺癌（NSCLC）是一种溶骨性癌，血浆外泌体高度表达Amphiregulin，它结合并持续激活破骨细胞中的EGFR。这导致蛋白水解酶表达增加，破骨细胞发生，并通过RANKL上调激活破骨细胞转移。L-plastin是一种参与细胞侵袭的肌动蛋白结合蛋白，通过MDA-MB231外泌体转移至破骨细胞，并通过RANK在体内诱导骨溶解。在MM中，外泌体调节破骨细胞前的迁移和破骨细胞分化，其特征是通过激活CXCR4途径升高破骨细胞标记物。相反，来自成骨细胞PrC的外泌体被转移到破骨细胞前体细胞，导致破骨细胞前体细胞增殖和分化的降低，以及破骨细胞分化标记物的减少。此外，来自PrC的miR-141-3p外泌体通过降低DLC1的表达促进成骨细胞活性、肿瘤生长和转移。此外，miR-940在成骨细胞癌的外泌体中高表达。miR-940体外转染骨髓间充质干细胞促进成骨转移。

脑转移目前还不清楚，肿瘤外泌体在介导脑PMN形成和转移中的作用尚不清楚。重要的是，表达avb3整合素（而不是其他有利于肝和肺器官向性的整合素）的脑向性外泌体被证明与大脑内皮细胞融合。不同的研究表明，来自BC的外泌体通过损伤ECs中的细胞-细胞连接蛋白ZO-1，从而导致BBB通透性增加以及通过外泌体Anx II激活脑间质中的p-STAT3和磷酸化p38-NF-kB。在另一项研究中，星形胶质细胞衍生的外泌体诱导肿瘤细胞发生癌变，从而增加脑转移。虽然外泌体介导的转移在其他器官中已经出现，但是关于大脑的研究还有很多需要了解。有一个未被满足的临床需求证明了进一步研究外泌体在肿瘤转移中的作用，特别是对于小细胞肺癌、BC和黑色素瘤的患者。

免疫介质： Traveling Niches

肿瘤分泌因子，包括外泌体，通过影响免疫系统和调节淋巴管生成在转移中起着关键作用。此外，淋巴器官的转移发生在许多类型的癌症中，通常是转移到其他器官之前的一个短暂的部位。外泌体介导转移的最早特征之一表明，B16F10黑色素瘤外泌体通过增加与血管生成、ECM调节、肿瘤细胞募集和生长相关的基因的表达促进PMN的形成。最近对黑色素瘤的研究表明，B16F10外泌体被肩胛下窦（SCS）169+巨噬细胞吞噬。正常情况下，SCS-169+巨噬细胞对肿瘤有抑制作用，可作为一种屏障阻止外泌体的传播。然而，在肿瘤进展过程中，这种屏障被破坏，使外泌体进入LN皮质并与B细胞相互作用，从而促进肿瘤生长。有趣的是，与其他外泌体亚群相比，B16F10细胞的外泌体被LN高度摄取，这表明它们可能在LN转移和与免疫系统的相互作用中起作用。在宫颈鳞状细胞癌中，外泌体表达高水平的miR-221-3p。miR-221-3p向淋巴管内皮细胞（LEC）的转运通过下调血管抑制因子vasohibin-1促进迁移和淋巴管生成，并促进小鼠LN转移。MDA-MB-231 BC细胞的外泌体通过刺激巨噬细胞极化至腋窝LN中的M2肿瘤支持巨噬细胞，促进原发性肿瘤生长和淋巴转移。在大肠癌中，外泌体IRF-2诱导前哨淋巴结巨噬细胞分泌VEGFC，导致淋巴管生成和转移。CD97在大多数GCs中过度表达，与肿瘤细胞分化和侵袭性有关。在体外，嗜淋巴性GC细胞外泌体高表达CD97，促进细胞增殖和侵袭。在小鼠中，脚垫内注射表达CD97的外泌体可提高LN中CD55、CD44v6、CD31、EpCam、CD151和CD97的表达并增强转移，这表明CD97通过与其他膜受体的相互作用支持PMN的形成。在肝细胞癌中，SDF-1a/CXCR4在侵袭和迁移中起重要作用。从高转移性肝癌（Hca-F）转移到低侵袭性肝癌（Hca-P）的CXCR4外体通过诱导MMP-9、MMP-2和VEGF-C的表达，促进Hca-P的迁移和侵袭。此外，来自Hca-F细胞的外泌体CXCR4促进了LEC的增殖和淋巴管的形成。这些研究表明，外泌体不仅在调节最终转移部位中起关键作用，而且它们还调节淋巴结部位作为肿瘤细胞在其最终目的地途中的称重站的能力。

临床意义

外泌体引起的耐药

耐药性是癌症治疗的一个主要障碍。有趣的是，来源于肿瘤细胞或CAFs的外泌体可以介导化疗和放疗（RT）抵抗。最初，有研究表明，耐药细胞可以在体外通过膜微粒将耐药性转移到药物敏感细胞。随后，研究表明，外泌体蛋白和小rna，包括长非编码rna（lncRs）和miRs，影响了耐药性，为这一现象提供了机制性的见解。在OvC细胞中，紫杉醇诱导miR-443表达，当通过外泌体转移时，miR-443在邻近细胞中诱导衰老，导致耐药性。同样，CAFs和肿瘤相关脂肪细胞分泌miR-21外泌体，可被OvC细胞吸收。MiR-21降低了APAF1的表达，导致化疗耐药和OvC细胞凋亡减少。M2极化巨噬细胞源性外泌体降低了对顺铂的敏感性，这些外泌体中的miR-21抑制了GC肿瘤细胞的凋亡并增强了PI3K/AKT信号转导。PaC的CAF外泌有助于治疗抗性；用吉西他滨治疗CAFs增加了富含蜗牛和miR-146a的外泌体的分泌。这些因素共同促进了CAF和肿瘤细胞的存活。在肾细胞癌中，lncARSR被包装入外泌体，从而转移对敏感细胞的耐药性。三苯氧胺耐药的BC细胞及其外泌体中lncR-UCA1表达增加。当用富含lncUCA1的外泌体处理三苯氧胺敏感细胞时，它们产生了三苯氧胺抵抗并显示出凋亡减少。间充质干细胞来源的外泌体被转移到骨髓瘤细胞并通过外泌体lncPSMA3-AS1赋予蛋白酶体抑制剂耐药性。

外泌体也可以通过诱导肿瘤干细胞增殖介导耐药。基质外泌体转移50个三磷酸RNA激活BC细胞的抗病毒RIG-I依赖性反应。这种激活诱导了肿瘤干细胞的扩张，从而介导了基底细胞样基底细胞对化疗和放疗的临床抵抗。CAF小泡介导miR-221转移到BC细胞，导致CSCs扩张并导致激素治疗抵抗。最后，外泌体介导的耐药与它们的RNA含量无关。骨髓瘤细胞暴露于常用抗骨髓瘤药物后，外泌体分泌增强。这些外泌体富含乙酰肝素酶，重组细胞外基质，改变肿瘤和宿主细胞的行为，导致化疗耐药。

治疗应用

外显体由于其天然、无毒、可生物降解的特性以及能够跨越包括BBB在内的各种生物屏障而成为一种很有前途的药物载体。最早证明外泌体具有这种潜在能力的工作之一，是通过在外泌体表面表达lamp2rvg，将外泌体设计成靶向中枢神经系统（CNS）的工作。这些外泌体含有siRNA，在全身给药后产生中枢神经系统靶基因的特异性耗竭。视网膜也是一个强大的生物屏障，与传统的AAV相比，包裹在外泌体（AAV2）内的腺病毒显示出更强的视网膜转导能力。在癌症模型中，PaC患者的外泌体被设计成增强了被受体细胞吸收的能力，同时也携带了靶向致癌KRAS的siRNA治疗药物。当用这些外泌体治疗PaC肿瘤小鼠时，原发肿瘤生长降低，证明了这种创新方法的有效性。近年来，利用促炎性免疫细胞的非修饰外泌体作为肿瘤治疗手段进行了探索。M1极化的抗肿瘤巨噬细胞产生的外泌体具有向LN的趋向性，被局部巨噬细胞和dc摄取。胞外体诱导了促炎细胞因子的释放，导致肿瘤生长抑制，并被证明是一种比CpG更有效的免疫增强剂，CpG是一种含有CpG基序以模拟病毒或细菌感染的DNA的免疫刺激合成DNA寡核苷酸，因此，它是免疫反应的强大刺激物。同样，NK源性外泌体在体外治疗后诱导B16F10细胞凋亡，并在体内抑制肿瘤生长。尽管在利用外泌体进行药物输送方面的这些进展有望改善治疗，但仍然存在挑战。有必要确定和优化外泌体的可交付物，以促进原发肿瘤和转移部位的最大吸收。

外泌体作为一种治疗癌症和其他疾病的工具越来越受到人们的关注，这导致了外泌体类粒子的发展，这些粒子通常是完全合成的，因此适合用于制药目的。此外，纳米颗粒的特异性可以被改变。例如，通过将蛋白质引入囊泡表面来实现特异性，并通过结合配体进一步提高特异性。纳米颗粒也易受电穿孔siRNA负载的影响，以诱导特定的击倒。最后，外泌体样颗粒被证明是靶向转移部位；聚乙二醇脂质体纳米粒积聚在肺转移灶内，大小小于1毫米。这种开创性的方法可能将外泌体的治疗潜力与药物的实用性结合起来。

体液活检外泌体的意义

由于外泌体代表其来源细胞，包含生物分子形式的信息，并分泌到血液中，因此它们是非侵入性液体活检和早期检测的理想候选体。因此，最近的工作一直在寻找合适的生物标志物或每种疾病的生物标志物组合。在黑色素瘤患者中，免疫检查点蛋白PD-1和CD28在来源于T细胞和树突状细胞的外泌体中的表达增加被发现可以预测治疗效果的改善。另外的研究表明miRs可以作为不同疾病类型的生物标志物。在急性髓系白血病中，复发仍然是一个关键问题，通常是治疗后微小残留病（MRD）的结果。然而，早期发现MRD可显著防止复发。外泌体miR-150、-155和-1246的联合表达在患者和健康个体之间存在显著差异，这表明这些标记物可用于MRD的早期检测。外泌体miR210和miR-1233的表达水平能够区分透明细胞肾癌患者和健康供体。血清外泌体miR-19b3p和miR-106a的增加可以预测GC并将患者与健康献血者区分开来，miR-7641预测了大肠癌。外体miR-223-3p在健康献血者血浆外泌体中表达较低，但其表达随着BC疾病的进展而增加。最后，在PaC中，外泌体miR-4525、miR-451a和miR-21的高表达与复发和预后差有关。有趣的是，DNA也可以作为一种预后工具；在PaC患者中，大量外泌体DNA数量和特异性外泌体DNA突变的频率被证明可以预测疾病的预后。

外泌体作为一种可靠的液体活检工具的主要障碍是建立一种最佳的分离方法。超离心（UC）是最经典也是最常用的外泌体分离方法。虽然UC在组织培养中具有健壮性和可重复性，但生物流体是凌乱的，而且很难获得一种干净的外泌体制剂。此外，加州大学将所有的外泌体子群体聚集在一起。非对称流场分馏（AF4）是一种很有前途的工具，可以克服后者，并提供快速和可重复的结果，但它需要在操作仪器和分析其生成的数据和大量起始材料方面的专业知识。其他外泌体分离方法包括微流控装置（MDs）、蔗糖梯度法（SGs）、大小排阻色谱法（SEC）和基于亲和性的外体分离试剂盒（AfBs）。尽管所有这些方法都有优点，但它们缺乏稳健性（MDs、SGs和SEC）或特异性（AfBs）。因此，寻找一种稳健性强、重复性好、特异性强、可广泛应用于临床的方法，对于外泌体作为诊断工具的主导地位至关重要。

展望

本文所讨论的工作强调了外泌体是多发性癌症中中性粒细胞发生和转移的关键决定因素（图1）；然而，仍有一些悬而未决的问题。今后，有必要全面了解外泌体生物学，特别是关于不同蛋白质、RNA和DNA包装的机制，以及在癌细胞中哪些特定的外泌体生物发生途径是活跃的。因为癌细胞外泌体含有独特的物质，因此，破译这些过程以及它们对癌细胞的选择性，可能会发现肿瘤特异性的治疗靶向途径。有趣的是，最近的研究发现了大量抑制ESCRT依赖性和非依赖性外泌体分泌的化合物，这表明这些药物应进一步测试其预防体内肿瘤转移的能力。此外，抑制Rab22a被证明可以减少外泌体分泌并损害BC细胞的转移表型，这表明与Rab27a类似，靶向Rab22a也可以防止体内PMN的形成和转移。最后，进一步研究不同外泌子群体与其细胞起源之间的关系可能会发现更多的治疗机会。

目前还不完全了解外泌体是如何对PMN中的受体细胞重新编程的，以及在没有外泌体的情况下PMN的持久性。到目前为止的研究表明，蛋白质和mir的持续外泌体转移对于维持PMN可能是必要的，但是是否由于表观遗传或遗传变化而导致更稳定的修饰也可能发生的研究较少。有趣的是，最近的研究表明，药物阻断外泌体摄取足以逆转PMN并抑制黑色素瘤的转移，这表明表型可塑性是可用于治疗的PMN的一个特征。然而，由于外泌体介导的PMN形成机制的多样性，PMN在其他癌症模型中的可重复性较低，因此这些发现应该在其他情况下得到验证。然而，正如这里所详述的，我们目前的知识突出了一系列外泌体依赖性途径，这些途径已经成熟，可以作为治疗靶向治疗转移。除了直接靶向外泌体进行治疗外，外泌体靶向治疗还应考虑其增强现有治疗（如免疫治疗）效力的潜在能力。

关于外泌体在调节已确定的转移中的作用，还有许多尚未回答的问题。（1） 原发肿瘤是否继续支持已建立的MN？（2） MN源性外泌体与原发性肿瘤外泌体有区别吗？（3）MN的外泌体是否会在其周围环境中引起进一步的变化，或者在其他远处器官中培养出中性粒细胞？（4）MN外泌体是否回到原发肿瘤？研究这些区域将提高我们对外泌体依赖性转移的理解，以便更好地利用外泌体作为转移疾病的生物标志物和治疗靶点。