m6A在癌症中的应用
表观遗传学是研究可逆和可遗传表型的学科，包括DNA和RNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA修饰和染色质重排。目前，RNA作为表观遗传学的一个重要分支，已发现存在有100多种化学修饰。1974年，在mRNA中首次发现腺嘌呤N6位置的甲基化。这种碱基修饰被称为m6A，是真核生物mRNA上最丰富的内部修饰。据统计，平均1000个核苷酸含有1-2个m6A残基。m6A主要出现在RRACH序列中，在终止密码子、3’-UTR和长内含子附近富集较多。m6A修饰的基本过程是由m6A甲基转移酶（Writer）添加，由m6A去甲基化酶（Eraser）移除，再被m6A读取分子（Reader）识别，从而调节RNA代谢。
越来越多的证据表明，m6A可以影响生物靶基因的表达，从而调节多种生理过程，包括细胞自我更新、侵袭和增殖。在分子机制上，m6A参与了几乎所有的RNA代谢过程，包括翻译、降解、剪接、输出和折叠。近年来，许多研究表明m6A广泛参与肿瘤调节，通过促进或抑制肿瘤相关基因继而调节肿瘤的发生发展。
MeRIP-seq介绍
RNA甲基化免疫共沉淀测序（Methylated RNA Immunoprecipitation Sequnencing，MeRIP-seq/m6A-seq）是基于m6A特异性抗体识别并结合mRNA上m6A的原理，以免疫共沉淀方法富集甲基化修饰片段为基础，并联合高通量测序，研究发生m6A甲基化修饰的mRNA 区域的手段。结合生物信息学分析，即可在全基因组范围内对m6A修饰的状况进行系统性研究。
文献分享：
案例一：靶向m6A阅读蛋白YTHDF1增强结直肠癌的抗肿瘤免疫和抗PD-1疗效[3]
标题：The m6A reader YTHDF1 promotes ovarian cancer progression via augmenting EIF3C translation
发表期刊：Gut
影响因子：24.5
发表时间：2023年1月
样本类型：CRC小鼠
所用技术：scRNA-seq、MeRIP-seq、RNA-seq、Ribo-seq
研究内容：
N6 -甲基腺苷（m6A）在肿瘤免疫微环境（TIME）中的作用仍未得到充分研究。此研究旨在阐明YTHDF1在结直肠癌（CRC）肿瘤免疫微环境中的作用及机制。作者设计在组织微阵列(N=408)和TCGA (N=526)队列中评估YTHDF1的临床意义。在同基因肿瘤、肠道特异性YTHDF1敲入小鼠和人源化小鼠中测定了YTHDF1的功能。采用scRNA-seq分析肿瘤微环境。采用MeRIP-seq、RNA-seq和Ribo-seq鉴定YTHDF1的直接靶点。用囊泡样纳米颗粒（VNPs）包封YTHDF1- siRNA在体内沉默YTHDF1。
结果发现在TCGA-CRC中，YTHDF1表达与IL-γ基因特征呈负相关。与此同时，在独立的组织微阵列队列中，YTHDF1蛋白与CD8+T细胞浸润呈负相关，暗示其在TIME中的作用。基因敲入YTHDF1增强了CT26(MSS-CRC）和MC38(MSI-HCRC）同基因肿瘤的抗肿瘤免疫，而在AOM或ApcMin/+模型中，YTHDF1敲除蛋白促进免疫抑制TIME促进结直肠癌。scRNA-seq发现，在YTHDF1基因敲除肿瘤中，髓源性抑制细胞（MDSCs）减少，同时细胞毒性T细胞增加。综合MeRIP-seq、RNA-seq和Ribo-seq发现p65/Rela是YTHDF1的靶标。YTHDF1促进p65翻译上调CXCL1，从而增加MDSC通过CXCL1- CXCR2轴的迁移。增加的MSDCs反过来在时间上拮抗功能性CD8+T细胞。重要的是，通过CRISPR或VNPs-siYTHDF1靶向YTHDF1可提高MSI-H CRC的抗PD-1疗效，并克服MSS CRC的抗PD-1耐药性。
总而言之此研究表明YTHDF1通过m6A-p65-CXCL1/CXCR2轴影响肿瘤抗肿瘤免疫，促进结直肠癌的发生，可作为免疫检查点阻断治疗的靶点。
案例二：吸烟诱导的M2-TAMs通过EVs中的circEML4，通过ALKBH5调控的m6A对NSCLC细胞中SOCS2的修饰促进NSCLC的进展[4]
标题：Smoking-Induced M2-TAMs, via circEML4 in EVs, Promote the Progression of NSCLC through ALKBH5-Regulated m6A Modification of SOCS2 in NSCLC Cells
发表期刊：Advanced Science
影响因子：15.1
发表时间：2023年5月
样本类型：NSCLC细胞
所用技术：MeRIP-seq、RNA-seq
研究内容：
肺癌是世界范围内的常见病，非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌发生中的85%。吸烟是一种促进非小细胞肺癌进展的环境暴露，但其作用尚不清楚。此研究报道，吸烟诱导的NSCLC组织周围M2型肿瘤相关巨噬细胞（M2-TAM）的积累促进了恶性肿瘤的发生。结果发现，香烟烟雾提取物（CSE）诱导的M2巨噬细胞在体内和体外均可促进NSCLC细胞的恶性化。来自CSE诱导的M2巨噬细胞的细胞外囊泡（EVs）中的circEML4被转运到NSCLC细胞，在那里它通过与ALKBH5相互作用减少ALKBH5在细胞核中的分布，导致N6-甲基腺苷（m6A）修饰升高。MeRIP-seq和RNA-seq揭示了SOCS2抑制因子通过调节m6A通过ALKBH5修饰SOCS2介导的JAK-STAT通路的激活。来自CSE诱导的M2巨噬细胞的EVs中circEML4的下调逆转了EVs增强的NSCLC细胞的致瘤性和转移。此外，此研究还发现吸烟患者circEML4阳性M2-TAM增加。这些结果表明，吸烟诱导的M2-TAMs通过circEML4在EVs中通过ALKBH5调控的SOCS2的m6A修饰促进NSCLC的进展。此研究还表明，TAMs的EVs中的circEML4可作为NSCLC的诊断生物标志物，特别是对于有吸烟史的患者。
案例三：N6 -甲基腺苷METTL3通过介导肿瘤抑制因子LATS1的m6A甲基化来调节乳腺癌的肿瘤发生和糖酵解[5]
标题：The N6-methyladenosine METTL3 regulates tumorigenesis and glycolysis by mediating m6A methylation of the tumor suppressor LATS1 in breast cancer
发表期刊：Journal Of Experimental & Clinical Cancer Research
影响因子：11.3
发表时间：2023年1月
样本类型：乳癌腺癌临床样本，人乳腺癌细胞系
所用技术：MeRIP-seq、RNA-seq、非靶代谢组
研究内容：
肿瘤相关因子的转录后修饰在乳腺癌的进展中起着关键作用。然而，其潜在机制尚不清楚。癌细胞中的m6A修饰是动态的和可逆的，并且已经发现通过各种机制影响肿瘤的发生和进展。作者采用MeRIP-seq、RNA-seq和非靶代谢组技术，揭示乳腺癌组织和细胞中m6A修饰图谱。通过RNA pull-down实验、RIP-qPCR、MeRIP-qPCR和RNA稳定性分析来确定乳腺癌细胞中m6A调控中m6A蛋白与LATS1之间的关系。结果作者发现m6A通过Hippo通路因子LATS1调控乳腺癌细胞增殖和糖酵解代谢从而发挥重要作用。METTL3是m6A的Writer蛋白，YTHDF2是LATS1 mRNA的Reader蛋白，在乳腺癌的肿瘤发生和糖酵解中都起着积极的促进作用。METTL3在LATS1 mRNA中诱导高水平的m6A修饰。YTHDF2通过识别LATS1 mRNA中的m6A位点，降低了其稳定性。敲除METTL3或YTHDF2蛋白表达增加LATS1 mRNA表达，通过激活Hippo通路中的YAP/TAZ抑制乳腺癌肿瘤发生。
总结
综上所述，目前针对m6A在癌症中的研究文献存在两种研究思路，一种是直接对肿瘤组织和正常组织/癌旁组织进行m6A测序，通过数据分析探究m6A修饰相关的Reader、Eraser、Writer基因表达水平是否发生改变，以及存在差异m6A修饰的靶基因，继而推导出m6A调控癌症表型的分子机制。另一种研究思路为先观察m6A相关基因在癌症样本/正常样本中表达是否存在差异，再通过在对应癌症模型细胞系中敲低/过表达差异m6A相关基因进行m6A测序，以寻找下游调控的靶基因，进一步阐释分子机制。目前m6A研究高分文章，多结合多种组学如RIP-seq、scRNA-seq、Ribo-seq等进行联合分析。以上的研究目的都是锁定核心基因和关键分子，从上下游将m6A修饰、转录因子、蛋白、lncRNA/circRNA与基因等相联系，从而达到文章的逻辑和实验闭环。
参考文献
[1] He L, Li H, Wu A, et al. Functions of N6-methyladenosine and its role in cancer. Mol Cancer. 2019 Dec 4;18(1):176.
[2] Meyer KD, Saletore Y, Zumbo P, et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 2012 Jun 22;149(7):1635-46.
[3] Bao Y, Zhai J, Chen H, et al. Targeting m6A reader YTHDF1 augments antitumour immunity and boosts anti-PD-1 efficacy in colorectal cancer. Gut. 2023 Aug;72(8):1497-1509.
[4] Cheng C, Wang P, Yang Y, et al. Smoking-Induced M2-TAMs, via circEML4 in EVs, Promote the Progression of NSCLC through ALKBH5-Regulated m6A Modification of SOCS2 in NSCLC Cells. Adv Sci (Weinh). 2023 May 28:e2300953.
[5] Xu Y, Song M, Hong Z, Chen W, et al. The N6-methyladenosine METTL3 regulates tumorigenesis and glycolysis by mediating m6A methylation of the tumor suppressor LATS1 in breast cancer. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Jan 7;42(1):10.
