作者，Evil Genius
从25年培训到如今，visium HD无论是项目经验还是文献思路都有了极大的丰富，很多在25年培训中关于HD穿插的项目经验都得到了验证，也有了很多新的内容，我们都总结总结，运用到项目中。
基本上stereo-seq和HD分析思路是一致的。
很多人我问一直做这个不无聊么？其实很简单，1、感兴趣，一直做也不觉得腻；2、没事干，也没办法做事，在家看着孩子；3、躺平心态，因为只要努力买房买车，背上负债，肯定撑不住，所以先当个咸鱼，有时候太穷也是有点好处的。
安稳有个班上是最好的。
今天我们分享文献
知识积累
多细胞生态系统是组织构成的基本单元，也是表型变异的关键要素。在癌症中，这类由免疫细胞、基质细胞和/或恶性肿瘤细胞形成的生态系统构成了动态的信号枢纽，能够强有力地影响疾病进展、免疫逃逸和治疗反应。
结果1、空间受限的TME细胞状态
通过对多种恶性肿瘤的单细胞和空间转录组数据进行整合分析，发现肿瘤微环境（TME）中的细胞状态受到空间位置的显著约束。
免疫与基质细胞的空间可塑性：CD8+ T细胞等在肿瘤不同区域（核心 vs. 边缘）会表达不同的标志基因（如核心区表达GZMB，边缘区表达GZMK），表明其功能状态与空间位置密切相关。
构建跨癌种空间图谱：研究者整合了涵盖10种肿瘤、132例样本的空间转录组数据，构建了包含460万个细胞的空间图谱，克服了不同技术平台的局限。
发现区域性特异表达基因：除了验证已知的极性基因（如GZMB、SPP1），还发现了新的具有区域特异性的基因。例如，PRDX1（抗氧化基因）是肿瘤相关NK细胞的核心标志物。
独立于细胞类型的空间代谢重编程：TME不同区域存在普遍的代谢差异。肿瘤核心区表现为广泛的代谢重编程，而肿瘤边缘则上调TNFα信号通路（标志基因如PKM和FOS）。
结果2、多细胞生态系统的空间图谱
Spatial EcoTyper 的机器学习框架，用于构建肿瘤微环境中多细胞生态系统的空间图谱，并以此首次鉴定出9种具有普遍性的空间生态型（SEs）。
方法创新：Spatial EcoTyper能够将不同细胞类型的基因表达谱与空间坐标信息进行“融合”，克服了以往方法忽略空间信息或无法跨样本整合的局限，在检测空间生态型方面优于现有方法。
空间梯度发现：通过对5个FFPE样本（含4种癌和1种黑色素瘤）的分析发现，TME中的多细胞程序呈现出精细的空间梯度变化，从肿瘤核心到周围基质形成连续轨迹。这种梯度与细胞距离肿瘤边缘的距离密切相关，且独立于传统的“免疫热/冷”分区。
鉴定9种空间生态型：将上述分析扩展到所有样本（共41,066个空间邻域）后，通过非负矩阵分解识别出9个具有强共关联性、互斥性和空间聚集性的聚类，即空间生态型（SE1-SE9）。它们按照与肿瘤边缘的平均距离进行编号。
结果稳健普适：这9种SEs在多种参数扰动、算法选择和输入数据下均能被稳定识别，表明它们代表了TME中组织构成的基本单元，反映了跨癌种保守的空间和转录变异规律。
结果3、SEs的跨平台验证
通过大规模、多平台的验证，确认了之前发现的9种空间生态型（SEs） 具有高度的普适性、稳健性和跨平台可重复性。
跨平台稳健恢复：在包含90个保留样本的验证队列中（涵盖6种空间转录组平台、黑色素瘤及9种癌种），9种SEs均能被稳定识别。通过定义38种SE富集的细胞状态，发现同一SE内的细胞状态在空间上显著共定位，且其空间连贯性和与肿瘤边缘的距离均符合预期。
跨数据类型的可发现性：即使在完全不同的平台（如Xenium Prime）上进行从头（de novo）识别，或使用算法分析（archetypal analysis），平均而言所有9种原始SEs都能被成功解析。
在单细胞数据中的可恢复性：通过参考指导的细胞标记，在144个肿瘤样本的scRNA-seq数据中，所有9种SEs均能被显著且特异地检测到。此外，在64个脑转移瘤样本（源自黑色素瘤及5种癌）中也恢复了大部分SEs，表明这些生态型在局限性及转移性肿瘤中均具有保守性。
结果4、SEs的生物学特性
解析9种空间生态型（SEs） 独特的生物学特征，揭示了它们各自富集的特定细胞状态、标志基因以及功能程序。
明确的三大空间功能群组：
基质侧生态型 (SE1)：最靠近肿瘤边缘的基质侧。特征为表达早期应答基因（如FOS、EGR1），富集初始/中央记忆T细胞、FOLR2+巨噬细胞等，代表相对“正常”的组织状态。
肿瘤核心生态型 (SE9)：最靠近肿瘤核心。特征为促血管生成，由TREM2+巨噬细胞和尖端样内皮细胞组成。
交界区生态型 (SE2-SE8)：主要位于肿瘤-基质交界处250微米范围内。功能多样，包括：多表型枢纽（如SE3含浆细胞、CAF等）、与伤口愈合相关的双表型枢纽（SE4）、免疫抑制型（SE5）以及两种促炎型（SE7在交界区，干扰素信号强；SE8在核心区，代谢活跃）。
稳健的分子标志物：鉴定出共识标志基因，这些基因不依赖于特定细胞类型或癌种，能稳健地区分不同的SEs，并与其功能程序相关。
跨生态位的信号交流：发现空间上邻近的非TME细胞（如恶性细胞亚群）也表达部分生态型的共识标志物，表明SEs可参与更大范围的多细胞组装体。
与既往研究的关联：发现既往通过RNA-seq反卷积鉴定的癌种生态型（如与免疫治疗获益相关的CE9）实际上是本研究中两种空间生态型（交界区的SE7 + 瘤内的SE8）的复合体，突显了本方法更高分辨率的发现能力。
结果5、SEs的数字细胞计数（解卷积）
从bulk基因表达数据中高效、准确地定量空间生态型（SEs） 的组成。
高精度的去卷积模型：利用来自10种癌症类型的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据和1000个人造（pseudo-bulk）肿瘤训练了一个非负矩阵分解（NMF）模型。交叉验证显示，该模型在预测SE丰度上具有很高的准确性，且性能优于现有的最先进去卷积方法。
跨平台一致性验证：在来自人类肿瘤图谱网络（HTAN）的42名患者的配对样本中（包括5种癌症），计算出的SE丰度在常规RNA测序（bulk RNA-seq） 与空间转录组（Visium ST） 之间表现出显著且特异的相关性，且这种相关性普遍不依赖于癌症类型或疾病状态。
技术平台间可重复性：在黑色素瘤的相邻切片上，使用Visium与MERSCOPE两种技术对815个重叠的空间位置进行分析，结果显示SE的微结构在两种检测方法间显著相关。这一结果在公开的Visium与Visium HD配对数据中也得到验证。
结果6、SEs的临床意义
空间生态型（SEs） 具有显著的临床预后预测价值。
显著的预后价值：在16种癌症类型中，9个SEs里有6个与总生存期显著相关。
不良预后：SE5（富集于肿瘤边缘，与EMT/TGFβ1相关）是导致生存期缩短的首要因素。
良好预后：SE7（交界区，抗原处理程序）和SE8（瘤内，代谢活跃程序）与更长的生存期显著相关。
癌种特异性：少数癌症（如前列腺癌）由于MHC表达低等因素，其SE的预后关联模式与其他癌种相反。
卓越的免疫治疗反应预测能力：在1249例接受ICI治疗的肿瘤样本中分析发现：
优于既往标准：SE8和SE7（它们是既往CE9生态型的“子生态型”）在预测ICI疗效方面，表现优于此前被认为与疗效相关的CE9本身。
识别耐药生态型：SE4（与伤口愈合相关的肌成纤维细胞/缺氧内皮细胞生态型）是预测ICI耐药的最强相关因素。
超越现有生物标志物：在多变量模型中，SE7和SE8在预测总生存期方面，表现优于肿瘤突变负荷（TMB） 和PD-L1表达（CD274） 这两个临床常用指标。
结果7、 Liquid EcoTyper 的深度学习框架
通过分析血浆游离DNA（cfDNA）的甲基化谱，来对肿瘤微环境中的空间生态型（SEs） 进行非侵入性的液体活检。
方法设计与训练：Liquid EcoTyper是一个二值神经网络，通过区分肿瘤与健康cfDNA的甲基化模式来定量SE水平。利用TCGA黑色素瘤数据（作为真实SE组成）与健康对照数据混合进行训练。
模拟数据验证：在保留的115个模拟黑色素瘤cfDNA样本中，模型对所有评估的SEs均显示出显著的定量相关性（P < 10e-6），且在13种癌种的初步分析中表现出普适性。
真实患者队列验证：在来自两个机构的23名黑色素瘤患者中，同时分析了肿瘤组织（空间转录组）和配对血浆cfDNA（全基因组甲基化测序）。
跨平台一致：血浆与肿瘤组织之间推断出的SE水平表现出良好且显著的相关性（9个SE中有7-8个显著相关）。
临床相关性：与免疫治疗反应呈正相关（SE7）和负相关（SE4）的两个SEs，其cfDNA丰度差异与组织中的结果一致。
信号特异性：患者PBMC（正常血细胞）中推断的SE水平与肿瘤或血浆中的水平均无显著相关，证明血浆中的SE信号主要来源于肿瘤，而非循环白细胞的污染。
结果8、Liquid EcoTyper 预测ICI响应
在78名接受免疫检查点抑制剂（ICI）治疗的转移性黑色素瘤患者中，通过血浆游离DNA（cfDNA）进行液体空间生态型（SE）分析，证实其能强效预测免疫治疗反应，且表现优于现有的循环肿瘤DNA（ctDNA）、肿瘤突变负荷（TMB）和PD-L1等临床生物标志物。
准确预测治疗反应：治疗前血浆中SE的水平与患者实际临床结局高度一致。
良好反应预测：SE7和SE8水平较高，与持久的临床获益、更长的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS） 显著相关（P<0.001）。
耐药预测：SE4水平较高，则预示着ICI耐药、更短的PFS和OS。
显著优于现有生物标志物：
优于ctDNA：高ctDNA水平仅与较差的OS有微弱关联，且在包含SE7/SE8/SE4的多变量模型中，ctDNA不再具有显著性。
优于TMB与PD-L1：在多变量调整后，三个液体SEs（SE7, SE8, SE4）与OS的关联强度均显著强于组织检测的TMB或PD-L1水平。
跨队列与多变量稳健性：这些预测关系在不同ICI疗法类型、黑色素瘤亚型、性别、年龄以及一个独立的外部队列中均保持稳健。
