拟南芥磷脂酰肌醇4,5-二磷酸通过控制网格蛋白介导的膜转运影响PIN极化

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实验方法

生长素含量的测定

生长素转运的测定

全组织的PIN的免疫荧光（PIN1和PIN2有商业化抗体）

CHX和BFA的处理

知识点

DR5::GFP，DR5::GUS定位

• 根尖

PIN1-GFP，PIN2-GFP的荧光定位，免疫荧光定位

• PIN1-GFP主要定位于（中柱）细胞的基底侧

• PIN2-GFP定位在皮层细胞的顶端

BFA处理

• 形成BFA小体

PIN相关的部分实验

1、生长素含量的测定

    pip5k1 pip5k2双突表型：短根，矮小。生长素水平正常，但是PIN1-GFP和PIN2-GFP的定位不正常

    PIN蛋白的极性分布是由于蛋白在不断地循环，运输到质膜上的特定位置造成的

    HPLC-ms测定幼苗的游离生长素含量，双突中生长素含量不变，但是从上向下的运输减少了【测定生长素的向基性运输，这咋测的，方法中有描述】

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    含量没变，运输变了

2、用DR5::GFP看生长素的分布情况

• 发现双突中DR5::GFP信号低，也不能响应外源IAA的施加。

  
  
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3、进一步在双突背景下转DR5::GUS

• 双突中DR5::GUS活性仍然低，IAA处理后也无法响应，对于NAA和2，4D有部分响应

  
  
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    到底是生长素的感知有问题还是生长素的运输有问题呢？

4、双突中生长素的感知有没有问题：

    IAA，NAA, 2-4D处理后，测量对照组和双突的根长，发现抑制作用类似。说明在双突中生长素的异常，不是由于感知生长素异常，而是通过影响生长素的运输。并且该实验暗示，外源施用IAA，并没有增加双突的根长【应该还需要做一组不处理的进行比较吧】

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    可溶酶的典型定位特征：清晰的质膜定位和微弱的胞质定位

    EYFP-PIP5K1 和 PIP5K2-EYFP具有极性定位，定位在质膜的顶端和基部。B中是脂质分布的marker。【量化的方法？？】

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5、是否改变PIN的分布

在野生型中，与之前报道的定位一致：

    PIN1-GFP主要定位于（中柱）细胞的基底侧

    PIN2-GFP定位在皮层细胞的顶端

在双突中，PIN1-GFP的荧光强度变弱，更弥散；双突中PIN2-GFP在侧边有时也有信号；

这表明，该基因的缺失，干扰了PIN1和PIN2的极化

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    那过表达该基因是否会影响极化呢？

    用PIN1和PIN2的特异性抗体进行免疫检测【免疫荧光？】，在野生型中展示的定位也与报道一致。

    在过表达材料中进行免疫定位显示，PIN1的荧光强度和定位与对照相似，但在相同的条件下，PIN2的定位与对照明显不同，展示出了较弱的质膜极性【为啥突变体的材料可以转PIN1-GFP直接看GFP，而过表达的材料，要用免疫荧光，没有一起过表达PIN-GFP呢】

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    过表达材料中，PIN2定位受到干扰，推测是由于PIN2的内吞转运受到干扰造成的（与本文中的基因功能相关，这里不作具体展开）

6、评估降低PtdIns(4,5)P2水平对PIN1-GFP和PIN2-GFP内吞循环的影响,

• cycloheximide (CHX)环己酰亚胺，蛋白合成抑制剂

• Brefeldin A (BFA) 是一种内酯抗生素，是蛋白质运输的特定抑制剂。通过阻止COPI被膜小泡的形成阻断分泌蛋白和膜蛋白从内质网向高尔基体的转运，文中说注意不要超过25 µM BFA】

    正常的野生型中，用BFA处理几分钟到60min即可观察到BFA小体的形成，表明，正常条件下，在质膜和endosomal compartments之间存在着大量的PIN1-GFP或者PIN2-GFP的消化循环。

    但在双突中，PIN1-GFP和PIN2-GFP经BFA处理后，形成的BFA小体明显减少，表明其内吞循环受阻。

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补充材料PIN1-GFP和PIN2-GFP的正常定位，和BFA处理后定位

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BFA处理

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