Integrated Proteogenomic Characterization of Clear Cell Renal Cell Carcinoma

肾透明细胞癌的综合蛋白质组学表征

期刊：Cell；影响因子：38.637

发表单位：约翰·霍普金斯大学等 

导 读

    肾透明细胞癌（ccRCC）占所有肾癌的75％，30％的患者在诊断时出现晚期疾病。但当前尚无有效的治疗方法，已发现ccRCC对常规化学疗法和放射线具有抵抗力，对于FDA批准的药物反应有限。2019年10月发表在《Cell》期刊上的一项新研究中，来自约翰·霍普金斯大学等的研究人员运用系统的蛋白基因组学方法深度揭示了肾透明细胞癌病理特征，并提出了基于综合组学分析的修订的分型方案。

    研究对来自103名尚未接受治疗（例如化疗和放疗）的患者的肿瘤样本，以及80处围绕肿瘤的健康组织样本，通过基因组学和蛋白质组学技术突出了蛋白质组学和表观修饰水平上的肿瘤特异性改变。研究指出，几乎所有肿瘤样品中都发生了3p染色体丢失，并根据其肿瘤微环境特征，鉴定了4种不同的基于免疫的亚型。其中，CD8阳性肿瘤患者对免疫检查点疗法的反应最佳，而VEGF免疫沙漠肿瘤患者对抗血管生成疗法的反应最好。结果说明了癌症发展的复杂性，除基因组学外，还可以使用蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学来了解有关癌症表型及其异质性的更多信息。

摘 要

    为了阐明驱动肾透明细胞癌（ccRCC）的功能模块失调，本研究对ccRCC和配对的正常邻近组织样本进行了全面的基因组、表观基因组、转录组学、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学表征。基因组分析确定了与基因组不稳定性相关的独特分子亚组。蛋白质组学测量的整合唯一地识别了受基因组改变影响的细胞机制的蛋白质失调，包括氧化磷酸化相关的代谢、蛋白质翻译过程和磷酸信号模块。为了评估单个肿瘤中的免疫浸润程度，还鉴定了微环境细胞特征，该特征描绘了四种以独特的细胞途径为特征的基于免疫的ccRCC亚型。

强 调

103 ccRCC病例的综合蛋白质组学表征；

描绘导致染色体3p丢失的染色体易位事件；

mRNA分析未揭示肿瘤特异性蛋白质组/磷酸化改变；

ccRCC的基于免疫的亚型，由mRNA、蛋白质组和磷酸化蛋白质组定义。

研究概要

1    肿瘤和NAT标本的蛋白质组学分析

    使用蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学方法分析了110个ccRCC和84个配对匹配的NAT样品，共定量了7150个蛋白和20976个磷酸肽。为了实现多组学数据集成，对所有110个肿瘤样品进行了全基因组测序（WGS）、全外显子组测序（WES）和总RNA测序（RNA-seq），以及107个肿瘤样品的DNA甲基化分析。基因组图谱评估发现了7个ccRCC具有非典型分子畸变的肿瘤，将它们排除在外，最后使用103个ccRCC和80个NAT组织样品的数据进行全面的蛋白质组学表征。

2    CPTAC ccRCC队列的基因组景观

    WGS分析显示3p染色体的臂级丢失是最常见的事件（93％）。14个肿瘤在所有染色体上均显示出广泛的CNV，这表明基因组高度不稳定。高基因组非整倍性与不良预后之间存在显著关联，这与研究中确定的基因组不稳定的高级别肿瘤的富集存在一致。先前的报道将染色体易位确定为ccRCC中3p丢失和5q并发的机制，作者通过研究队列中出现的染色体重排的频率和类型，观察到61％的ccRCC病例显示出一个或多个易位事件，主要涉及3p染色体基因座。6个肿瘤中观察到3p杂合性（LOH）的丧失，103例ccRCC肿瘤中有102例显示3p失调的证据。

    与TCGA队列相比，CPTAC ccRCC队列中的体细胞突变描述了相似的特征。VHL失调是最常见的变化，在85％的肿瘤中观察到。PBRM1、BAP1、KDM5C和SETD2的突变率分别为43％、17％、18％和16％。作者进一步检查了这些高频突变基因和甲基化对其各自的mRNA和蛋白质水平的影响，总体而言，基因组失活事件会导致mRNA和蛋白质表达降低，表明突变导致的功能丧失并支持将这些基因分类为ccRCC抑癌基因。此外，启动子CpG岛的甲基化增加导致致癌表型。

图1，基因组改变及其与mRNA、蛋白质和磷酸蛋白丰度的关联。（A）在CPTAC队列中观察到的绝对拷贝数估计值的分析，并展示了染色体易位事件、肿瘤分级、CpG岛甲基化子表型（CIMP）状态、基因组不稳定性和CNV丢失/获得等信息，带有3p杂合性丧失（LOH）证据的ccRCC肿瘤由***表示。

3    基因组改变的综合蛋白质组学分析

    作者进一步整合mRNA、蛋白质和磷酸肽水平，确定了对转录、翻译和翻译后水平（顺式效应级联）存在显著影响的基因组变异，并鉴定出与肿瘤级别相关、癌与非癌组织间差异表达的基因靶点。已识别的CNV顺式级联包括SQSTM1（5q35.3）、OSBPL3（7p15.3）和GOLPH3（5q13.3），它们与PI3K-mTOR信号相关。确定了一个涉及多功能转录因子YY1（14q32.2）的顺式级联反应，YY1丢失将HIF-2α信号转导与ccRCC中的MYC表达联系在一起。通过VHL附近的甲基化事件识别了VGLL4（3p25.2）、PLCL2（3p24.3）和IQSEC1（3p25.2）的顺式调节作用。

    作者还关注了这些由主要CNV或突变事件驱动的细胞过程。3p染色体的丢失与缺氧信号的上调、细胞周期调节和糖酵解、氧化磷酸化的下调、脂肪酸代谢和TCA周期有关。5q扩增导致mTORC1和MYC信号转导增加，7p扩增导致蛋白质翻译和上皮间充质转化（EMT）增加。HIF-1α和HIF-2α的表达增加是一种在VHL缺失时上调缺氧信号的机制，HIF1信号传导会改变线粒体活性，并推动代谢从氧化磷酸化转变为糖酵解。75%的CIMP+肿瘤存在14q缺失，具有与氧化磷酸化增加和粘着斑减少相关的独特特征。

图2，拷贝数变异（CNV）对蛋白质丰度的影响。（A）DNA变异与级联顺式关联（与所有类型的mRNA、全局蛋白和磷酸肽丰度相关），以及根据临床特征（肿瘤与NAT和肿瘤等级）征显著分化的磷酸肽重叠。

4    转录组与蛋白质组表达的相关性

    为了解转录组和蛋白质组学过程之间的调控关系，作者计算了mRNA和蛋白表达的相关性。氧化磷酸化、剪接体和核糖体通路在肿瘤中的相关性较差，而NAT中剪接体和核糖体的持家活动呈现出明显的相关模式，代表了维持细胞内环境稳定的调节轴。将高样本相关性与增加的蛋白质翻译联系起来，确定了核糖体和翻译因子蛋白质表达的一致增加。通过描绘Pol I转录调控增加核糖体生物发生的机制，检测到MYC靶标和mTORC1信号基因的蛋白质表达相应增加，样本相关性较高的肿瘤中的转录激活因子ECT2和Pol I转录抑制剂FGF13的mRNA水平降低。有趣的是，肿瘤中不协调的核糖体蛋白- mRNA水平发生了协同转移。导致肿瘤中核糖体mRNA和蛋白质表达解偶联的失调机制尚不清楚，这表明在评估核糖体生物发生作为ccRCC的治疗靶点时，蛋白质证据的重要性。

图3，转录组和蛋白质组学丰度之间的相关性。（B）肿瘤样本按相关性分为高（蓝色）、中（灰色）和低（金色）的转录组和蛋白质组丰度相关；（C）肿瘤样品）和相应的NAT中核糖体和翻译因子基因表达的框线图以及与Pol I相关的调节。

5    ccRCC与NAT相比的蛋白质组学变化

    ccRCC的特征在于特殊的基因组改变，已将其归类为代谢性疾病，这使作者重点关注了参与细胞代谢的差异mRNA和蛋白。与NAT相比，肿瘤组织中共计255种上调的蛋白质，涉及免疫反应、EMT、糖酵解和mTOR通路；565种下调蛋白参与则与TCA周期、脂肪酸代谢和氧化磷酸化有关。分析肿瘤与NAT之间mRNA和蛋白水平的差异丰度后发现，肿瘤中氧化磷酸化mRNA和蛋白表达存在显著解偶联，这反映了在翻译水平上对特定氧化磷酸化成分的调节。这些结果表明，Warburg效应的功能性后果并未在转录水平上完全被捕获，这可能会影响基于转录的代谢特征在ccRCC预后中的临床应用。

图4，ccRCC肿瘤与NAT之间的转录组和蛋白质组学差异。（B）分析ccRCC肿瘤和NAT之间显著差异调节的途径；（C）糖酵解和电子传输链的示意图，其中ccRCC肿瘤和NAT之间的mRNA和蛋白水平具有选择性的差异基因表达。

6    激酶和底物调控途径的磷酸化蛋白质组学分析

    磷酸化影响多个细胞过程，其位点的占据受到其各自底物上激酶和磷酸酶活性的严格控制。作者基于差异磷酸肽进行激酶-底物分析，确定了CDK1和MAPK1是大多数肿瘤中最重要的两种磷酸底物事件。磷酸位点丰度的细胞周期调控网络显示，与S期进入/进展（CDK7-MCM2）和G2/M检查点（WEE1-CDK1）相关的磷酸化底物在大多数肿瘤中均升高，这表明G2抑制机制在防止肿瘤的有丝分裂阻滞诱导的细胞凋亡中起作用。几乎在所有肿瘤中，上游受体酪氨酸激酶表皮生长因子受体（EGFR）的蛋白质和磷酸肽表达均增加，而血管内皮生长因子（VEGF）受体更多在肿瘤中选择性表达和磷酸化。作者还从升高的底物磷酸位点的占有率推断激活的信号传导，EGFR/VEGF下游信号通路MAPK/ERK和AKT-mTOR的激活在下游底物EIF4EBP1上汇聚，这表明针对mTOR和MAPK/ RK途径的联合治疗可能更为有效。PKM磷酸化在ccRCC肿瘤队列中具有很高的排名，并且与较低的肿瘤等级相关，反映了ccRCC肿瘤子集中由EGFR介导的糖酵解重编程的次级机制。因此，磷酸化蛋白质组学分析确定了在肿瘤中激活的多种信号转导途径，并为扩大治疗选择范围提供了证据。

图5，磷酸化底物与相关激酶和特定于磷酸化肿瘤数据的网络模块。（A）具有抑制剂的激酶的磷酸化底物事件的等级，以及分别在激酶和底物的全局和磷酸水平上的倍数变化；（B）基于所选磷酸底物和激酶的途径，相关药物靶标显示红色，当前FDA批准的ccRCC药物显示灰色。

7    ccRCC中的免疫浸润的表征

    为了深入了解ccRCC中免疫浸润的特征，作者使用xCell分析了103个肿瘤和72个NAT的转录组谱以及去卷积的免疫、基质和微环境细胞基因特征。采用基于免疫的分组，并结合转录和蛋白质的功能，定义了四种肿瘤亚型：（1）CD8+炎症，（2）CD8-炎症，（3 ）VEGF免疫缺陷，以及（4）代谢免疫缺陷。这些亚型的特点是独特的基因组改变和肿瘤微环境（TME）签名，以及可以用于预测治疗反应的信号通路的区分。基于这四个亚型的患者分层显示，VEGF免疫性缺陷肿瘤与患者生存期改善相关，而CD8+炎症肿瘤与患者预后不良相关。后一个结果反映了被认为是ccRCC预后不良的CD8+炎症亚型中多个特征的聚集，包括更高频率的BAP1突变，更高级别肿瘤的比例增加以及PD-1/PD-L1表达。

图6，ccRCC肿瘤的基于免疫的亚型。（A）使用xCell在103个ccRCC肿瘤和72个NAT中基于转录组的mRNA转录细胞特征的去卷积，分子特征（转录组、蛋白质组学）将肿瘤分为四种免疫亚型：CD8 +发炎（红色）、CD8 −发炎（蓝色）、VEGF免疫沙漠（黄色）、代谢免疫沙漠（绿色），以及NAT分为两种亚型（粉红色和灰色）。（E）每种免疫亚型的免疫和基质得分的密度等值线。基于RNA-seq和整体蛋白质组学数据上调的途径分别标记为“R”或“P”。

8    ccRCC的蛋白质组肿瘤间异质性

    肿瘤分级是ccRCC的重要预后因子，通常与更高阶段和更大的肿瘤有关，作者结合临床特征分析了与免疫和基质评分以及肿瘤等级相关的差异基因。高级肿瘤中，mRNA和蛋白质水平的翻译、mTOR信号转导和EMT增加。低度肿瘤在mRNA和蛋白质水平上均显示受体酪氨酸激酶、RAS、MAPK、Notch和RAP1细胞信号通路的表达增加，同时上调转录相关过程的蛋白表达。高等级和低等级肿瘤之间的细胞过程的差异反映了不同的肿瘤需求，更高等级的肿瘤上调机制以适应增加的基因组改变和变化的肿瘤微环境。

    为了确定CPTAC队列的ccRCC肿瘤间异质性，作者还将ccRCC根据肿瘤的蛋白组差异分为3组。ccRCC1上调适应性免疫、N-糖基化修饰、OXPHOS和脂肪酸代谢相关蛋白，与高级别和晚期肿瘤有关。ccRCC2肿瘤高表达天然免疫和血小板脱颗粒相关的蛋白。ccRCC3上调糖酵解、mTOR信号、低氧相关的蛋白。ccRCC2和ccRCC3与较低的肿瘤级别相关，而仅有ccRCC2与肿瘤早期相关。 

图7，ccRCC的蛋白质组学肿瘤间异质性和相关的功能途径。（B）蛋白质组学丰度热图，临床和分子特征显示在热图上方。使用Hallmark Gene签名、REACTOME和KEGG对源自簇的模块进行注释。

讨 论

    总体而言，这项研究揭示了独特的生物学见解，只有将互补的蛋白质组学和基因组分析结合，才能将基因组畸变的功能性后果与蛋白质组学成果联系起来，获得独特的生物学见解。全面的基因组、表观基因组、转录组学、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学测量方法对肿瘤和相应的NAT的整合，为深入研究ccRCC肿瘤发生提供了宝贵的生物信息资源。多层次组学分析可确定在基因组和转录组水平上尚未完全捕获的潜在分子机制，并定义对ccRCC患者进行分层所必需的蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学和免疫标记，以开发合理的治疗性干预措施为目标。