大名鼎鼎的Annexin V-FITC/PI双染法，是大家最常的流式凋亡检测方法。但是想得到一组既漂亮又“炫”的流式结果图却不是一件容易的事情，需要同学们每一步都做到精致完美，任何一个小环节的失误，都会使几天的努力功亏于溃，毁于一旦。
那么，整个细胞凋亡实验过程需要注意些什么问题?有哪些不能忽略的实验小细节呢?今天，我们一起来学习学习。
Annexin V-FITC/PI双染法基本原理
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)位于细胞膜的胞浆侧。细胞发生早期凋亡后，PS外翻到胞膜侧，Annexin V对PS有高度亲和力，用FITC标记Annexin V，PS外翻的细胞由于结合Annexin V-FITC发出绿色荧光。凋亡晚期，细胞膜结构受损，碘化丙啶(PI)透过细胞膜进入细胞，细胞同时发出红色荧光和绿色荧光。同时检测Annexin V-FITC(绿色荧光)和PI(红色荧光)的信号，对早期凋亡和晚期凋亡的细胞比例进行分析。
实验中的小细节
一、如果可以，尽量选择活力旺盛的“青年”细胞
细胞凋亡想做好，细胞状态选择最重要。
为什么要选择活力旺盛的细胞?大家都知道生长代数越靠前的细胞活力越旺盛，在条件容许的前提下，尽量选取传代次数较少的细胞。
为什么要选择“青年”的细胞?培养器皿中的细胞是一个微形群体。传代后，营养物质充裕，细胞群体中的“baby”细胞比较多。随着不断生长分裂，细胞数越来越多。当细胞融合度达到80%左右时，群体中的“青年”细胞的比例达到顶峰，此时的细胞状态最好，最适宜做凋亡实验。如果细胞继续培养，生存空间不足，营养物质匮乏，“老年”细胞逐渐变多，此时检测到细胞本身凋亡百分率就会很高。
二、过度消化会损伤细胞
流式检测的样本必须是单细胞悬液，对于贴壁培养的细胞，需要用胰酶降解细胞间结合处蛋白，使细胞相互分离。但胰酶是一把双刃剑，如果处理时间太长，也会损伤细胞。所以需要尽量去除延长消化时间的因素，比如，尽量去除清洗培养基的PBS，避免残留PBS稀释胰酶。当样本较多时，建议分组消化细胞，严格控制胰酶处理时间在1分钟内。
三、胰酶消化，加EDTA or not?
EDTA螯合钙离子，影响Annexin V和细胞膜上的蛋白结合，因此许多凋亡试剂盒的protocol都特别标明，用于细胞凋亡实验的胰酶不能含有EDTA。从另一个方面讲，胰酶中加入EDTA，可以加快细胞从培养器皿上脱离的速度，避免胰酶长时间消化造成的细胞损伤。
胰酶中到底要不要加EDTA?是一个两难的选择?
其实，应该具体问题具体分析，有的细胞容易消化，当然用不含EDTA的胰酶。如果用胰酶消化几分钟后，大部分细胞仍然牢牢地吸附在培养器皿上，就建议选择含有EDTA的胰酶消化细胞，可以通过洗涤去除EDTA来保证Annexin V和细胞膜上的蛋白结合。
四、染色前或染色后的细胞可不可以固定?
当然不可以。如果你温习细胞凋亡检测的基本原理，就知道，固定会破坏细胞的完整性，使PI透过细胞膜进入细胞，提高细胞的凋亡百分率。所以，染色前和染色后的细胞都不可以固定，并且染色后的细胞需要在1小时内上流式检测。
五、表达GFP荧光的细胞是否可以使用此方法检测?
当然不可以。GFP和FITC都由488nm激光激发，二者发射光谱有极大的重叠。如果表达GFP荧光的细胞用此法检测细胞凋亡，FL1通道获得的荧光信号就是GFP和FITC的加和，不能真实地反应细胞凋亡的变化。所以，被检测细胞本身不能发出与FITC或者PI染料有光谱重叠的光。如果有，果断换用其他检测方法。
六、每个细胞都需要被温柔以待!
机械力会损伤细胞，操作过程中的任何暴力行为，都会使细胞本身凋亡百分率变高。要想实验结果好，尽量地少吹打细胞，因为每个细胞都值得被温柔以待!
注意好以上这些小细节，你才能得到一张“炫”丽多彩的流式结果图，但是，如果细节都到位了，实验还是做不好该怎么办？——或许你可以尝试使用更优质的Annexin V-FITC/PI检测试剂盒。
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1、多种标记物(FITC、PE、APC、AF647/PI、7-AAD)选择，满足不同待测样本和检测仪器的需求;
2、多种试剂盒相关组分在售，灵活满足不同的实验需求;
3、检测早期凋亡最理想的方法，不需固定环节从而避免相关的假阳性;
4、只需15-20分钟，简单快捷;
5、严格可靠的质量控制，保证优异的实验结果;
6、专业的售前售后技术支持，帮助您更好完成凋亡实验。
实验效果图如下：
图：Jurkat细胞用1μM喜树碱(Camptothecin) (左) 或未加药 (右) 处理4 h，Annexin V-FITC/PI检测试剂盒染色后FCM检测。Annexin V-FITC单阳为早期凋亡细胞，Annexin V-FITC和PI双阳细胞为坏死或晚期凋亡细胞，PI单阳细胞为裸核细胞。
怎么样，是不是非常地“炫”呢?
好了，学霸姐姐只能帮你到这里了，剩下的，就靠你自己了！
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