一、 HIV快速检测技术原理
HIV检测试剂的发展经历了从酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）到快速检测（rapid diagnostic tests, RDTs）试剂，再到核酸检测（Nucleic Acid Amplification Tests，NAAT）等多个阶段。其中，基于㬵体⾦的快速检测试剂以其操作简便、快速出结果的特点，在HIV感染的初步筛查中发挥了举⾜轻重的作⽤。
㬵体⾦HIV检测试剂主要采⽤免疫层析技术，也称为㬵体⾦免疫层析法（Gold Immunochromatography Assay, GICA）或侧向层析法（Lateral Flow Immunoassay，LFIA）。其基本原理是利⽤抗原抗体特异性结合的原理，将㬵体⾦标记的抗体或抗原与待测样本中的HIV抗体或抗原发⽣免疫反应，并通过层析作⽤在试纸条上形成⾁眼可⻅的检测线（T线）和质控线（C线），从⽽实现对HIV感染的定性检测。
㬵体⾦是由⾦盐还原⽽成的纳⽶级⾦颗粒，具有良好的⽣物相容性和独特的物理化学性质。其表⾯带有负电荷，可通过静电吸附或共价结合的⽅式与蛋⽩质（如抗体、抗原）结合，形成稳定的㬵体⾦标记物。在HIV检测试剂中，通常将HIV抗原标记在㬵体⾦颗粒上，作为⽰踪剂。使用胶体金平台检测HIV的国内厂家有北京蓝十字、北京金豪、上海科华、北京万泰、厦⻔英科新创、汕头大卫、南通伊仕、杭州艾康、广州万孚、北京⾦伟凯、天津中新科炬、山东康华、青岛汉唐、杭州隆基、上海凯创、北京捷乐、北京库尔、北京宝瑞源、江苏维尔、迈克生物、广东伊康纳斯。
除了胶体金外，还有许多厂家采用彩色乳胶颗粒作为示踪剂，乳胶法HIV层析试纸核心原理与胶体金法类似，但标记物为彩色乳胶微球而非金颗粒，乳胶微球（粒径0.1~1μm）具有光散射放大效应，比胶体金更易肉眼观察，尤其适用于低浓度抗体检测。可通过化学修饰连接更多抗原，增强结合效率；且颜色多样（红、蓝、绿），便于多指标联检。乳胶微球不易聚集，批间差异小，适合大规模生产。国内有越来越多的厂家选择了彩色乳胶法平台，例如杭州艾博、杭州博拓、杭州奥泰、广州海力特的HIV检测试剂盒采用的便是乳胶法。
雅培的四代HIV检测试剂用的是胶体硒法，㬵体硒作为⼀种新型的纳⽶标记材料，其原理与胶体金类似，也是通过与⽣物分⼦结合形成有⾊复合物进⾏检测。相较于㬵体⾦，㬵体硒在某些应⽤中可能表现出更⾼的灵敏度或不同的光学特性。除了雅培，国内广州健仑生物提供的人类免疫缺陷病毒（HIV）1+2型抗体检测试剂盒采用的也是胶体硒法。
HIV快速检测试剂普遍采用双抗原夹心法，HIV抗体作为‘桥梁’同时结合胶体金/乳胶/胶体硒标记的抗原和固定在膜上的抗原。若样本中存在HIV抗体，胶体金/乳胶/胶体硒标记抗原—抗体复合物被T线捕获，形成可见红线；若无抗体，则仅C线显色（阴性）。整个检测过程通常在15-20分钟内完成，使用快速方便，不仅适用于医疗机构筛查，也适用于个人居家自测。
二、 HIV快速检测技术发展历史
1989年，美国PATH公共卫生专家Freya Spielberg等首次将胶体金标记技术应用于HIV抗体检测，建立了斑点金免疫渗滤试验（GIFA）。该方法以硝酸纤维素膜为载体，通过渗滤作用实现抗原抗体反应，胶体金作为显色标记物，检测时间仅需数分钟。同年EASE medtrend创始人Peter Chun等也开发出了基于GIFA法的HIV抗体检测试剂盒，对3878份献血员血清进行测试，敏感性和特异性分别达98.6%和98.8%。
1990年，美国宾夕法尼亚大学医学院的G. Osikowicz等提出胶体金免疫层析试验（GICA），将渗滤改为层析模式，应用于定性检测尿液中的人绒毛膜促性腺激素（hCG），样品通过毛细作用侧向流动，胶体金标记物与待检物结合后，在检测线处聚集显色。该技术相较于斑点金免疫渗滤法操作更简便，之后成为胶体金检测的主流方法。
1992年美国食品药品监督管理局（FDA）批准了Murex Corporation公司的一款 HIV 快速检测试剂SUDS HIV-1（Single Use Diagnostic System HIV-1 test），SUDS HIV-1这款试剂是 HIV 快速检测领域的一项重要突破，能够在约 10 分钟内提供检测结果，但因性能局限被后续更可靠的快速检测方法取代。Murex于1998年被Abbott收购，交易价值约为 2.34亿美元，这次收购帮助 Abbott 扩大了其在快速诊断市场的业务范围。
1992年FDA同时批准了另一款来自Cambridge Biotech Corporation 公司的Recombigen HIV-1 LA Test试剂，这款试剂同样属于快速HIV检测试剂，它采用的方法是乳胶凝集试验（Latex Agglutination Test）。利用特制的乳胶颗粒，这些颗粒表面包被有重组gp41/gp120抗原。当待测样本（如血液、血清或血浆）中存在相应的HIV抗体时，会与乳胶颗粒上的抗体发生特异性结合，导致乳胶颗粒凝集成块，通过观察这种凝集现象即可判断结果。
2002年FDA批准了OraSure Technologies公司的OraQuick Rapid HIV-1 Antibody Test试剂，它是当年HIV检测领域的一项重要进展，以其快速、便捷的特点显著提升了检测效率。OraSure是全球唾液检测领域的领军企业，由于OraQuick的检测样本是唾液，该公司已在美国的牙科诊所推广OraQuick。
1998年左右，Chembio Diagnostic Systems开发的SureCheck HIV-1/2 Rapid Test试剂获得FDA批准，Inverness Medical 与 Chembio 签署合作协议，获得部分 Chembio 产品在特定市场的分销权和推广权。2007年，Inverness Medical被Alere收购，2010 年，Inverness改名Alere Inc. 后，继续代理/分销Chembio的部分产品。随后Alere在2017年被Abbott Laboratories收购，随着 Abbott 收购Alere，部分 HIV 快速检测业务也转入Abbott体系，但Chembio仍保持独立公司身份，并自行生产销售自己的品牌产品。
1990年代中期，日本的第一三共株式会社（Daiichi ）开发了Determine HIV-1/2 抗体快速检测技术，1990年代后期，Inverness Medical 与 Daiichi 合作，将Determine HIV-1/2 抗体快速检测推向国际市场，2000年后Inverness Medical 与 Daiichi 合作不断更新Determine产品版本（第三代HIV抗体检测），2005年两家开始合作研发第四代HIV检测试纸（HIV-1/2 Ag/Ab Combo），历经多年创新，这款试纸于2008年在墨西哥城举行的国际艾滋病大会（AIDS 2008）上首次亮相。Determine HIV-1/2 Ag/Ab Combo的技术进步和市场应用对 HIV诊断领域产生了深远影响。尽管Inverness Medical（Alere Inc.）被Abbott收购，这一系列收购影响了其产品品牌的演变，但最初的研发工作仍具有延续性，Determine®系列名称保留至今。2013年Abbott的HIV四代检测试剂Determine HIV-1/2 Ag/Ab Combo test获得FDA批准上市。
2012年，上海科华生物的“人类免疫缺陷病毒（HIV1/2）抗体诊断试剂盒（胶体金法）”首次被列入WHO供应商名录，在WHO比利时实验室的453例样本测试中，灵敏度与特异性均为100%，无漏检或误判，成为首个国际认可的国产产品。2018年中国CDC质量评估中，HIV胶体金与HIV酶免试剂再次双获100%满分。试剂中采用的重组抗原经过十多年创新优化，在灵敏度和特异性方面有较强优势。
2019年全球首个获批上市的HIV尿液自检试剂是由厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心与北京万泰生物药业股份有限公司联合研发的“人类免疫缺陷病毒1型尿液抗体检测试剂盒（胶体金法）”。HIV抗体在尿液中的浓度仅为血液的1/1000，传统方法难以检出，对重组抗原的灵敏度和特异性有极高要求，可见厦门大学夏宁邵院士团队在HIV重组抗原性能改造上有了突破性进展。
三、 胶体金颗粒与gp41抗原结合特性
胶体金颗粒的尺寸范围为1-150nm，常用20-40nm（这一尺寸范围在灵敏度和稳定性之间有较好的平衡），gp41抗原（分子量通常在40-50kDa左右）在溶液中的有效尺寸（流体力学半径）通常在几纳米到十几纳米之间，标记物最终的形态是以胶体金颗粒为核心，表面偶联多个gp41抗原分子，形成胶体金-蛋白复合物。蛋白质间静电斥力有助于复合物稳定，因为蛋白质表面带电荷（取决于pH和等电点），可以防止胶体金颗粒聚沉。
在胶体金标记gp41抗原的过程中，使用 K₂CO₃（碳酸钾）调节pH值优化胶体金颗粒与gp41抗原之间的结合环境，以提高标记效率和复合物的稳定性，通常将胶体金的pH调节到略低于gp41等电点的范围（通常5-7，具体取决于蛋白质的pI值），可以维持胶体金的分散状态，避免沉淀，促进gp41抗原分子在胶体金表面均匀吸附，使抗原分子以适当的取向和密度附着在胶体金表面，从而提高标记物的灵敏度和特异性。
由此可见，gp41标记抗原的分子量和等电点设计对于实验结果非常重要，一般通过加融合标签来改善gp41抗原的等电点，进而改善gp41标记性能。
四、 gp41包被NC膜的结合特性
静电作用了是gp41包被NC膜的初始作用力。NC膜本身是带负电荷的，其表面存在羧基等带负电的基团。当缓冲液pH高于gp41抗原的等电点(pI)时，蛋白质分子整体带净负电荷。因此当pH > pI时，gp41抗原带负电，NC膜带负电，两者间的静电排斥力会阻碍抗原靠近膜表面，不利于吸附。相反，当pH < pI时，gp41抗原带正电，与带负电的NC膜之间存在静电吸引力，这会促进初始的吸附（尽管疏水作用仍是主导）。静电作用（吸引力或排斥力）除了受缓冲液PH影响外，离子强度的影响也很大，高离子强度会屏蔽电荷，大大减弱静电作用。
疏水作用是物理吸附中相对更稳定、受离子强度影响较小的力，长期稳定性主要还是靠疏水作用，gp41抗原通过其表面的疏水区域与NC膜的疏水骨架相互作用，这是最主要、最稳定的结合力，氢键作为次级作用力参与结合。包被时，gp41抗原首先通过疏水相互作用结合到NC膜上，这是物理吸附的典型起始过程，基于疏水匹配。
由此可见，gp41抗原及其融合蛋白的疏水区分布对gp41抗原表位的正确暴露极为关键。如果gp41抗原主要通过疏水作用“趴”在膜上，那么其表面的疏水区分布将直接决定哪个面包埋在膜里，哪个面暴漏在溶液中。暴露在溶液中才能被样本中的抗体结合。因此，控制疏水区分布对于表位正确暴露至关重要。此外，抗原分子量影响扩散速率和在膜表面的空间位阻，等电点影响抗原与膜的结合。这些因素在抗原设计中都要充分考虑。
五、 总结
gp41抗原的设计需要考虑应用目的，是做包被还是标记，在序列的截取和融合蛋白的设计上需要综合考虑，理性设计。最终表达的蛋白还需要进行充分验证，找准下次改进设计的方向和思路，由此一步一步进行迭代改进方能制备出符合应用的好抗原。
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