二代测序数据评估软件： FastQC
测序质量分析：
包含多项内容，如测序reads碱基质量、GC含量、reads长度、k-mer分布
Basic Statics中统计了测序数据类型、测序平台、测序数据中包含的总reads数、测序reads长度范围及测序reads的平均GC含量等
Per base sequence quality
以箱线图的形式展示了测序reads沿5’到3’方向所有碱基的测序质量值的分布。图中，横坐标为碱基在reads中的位置，纵坐标为单碱基错误率Q，其中Q = -10*log10（error P）即20表示1%的错误率，30表示0.1%。
根据测序技术的特点，测序片段末端的碱基质量一般会比前端的低，属正常现象。若reads末端测序质量明显较差，可考虑将末端碱基统一裁剪去除。
若任一位置的下四分位数低于10或中位数低于25，报“WARN”；若任一位置的下四分位数低于5或中位数低于20，报“FAIL”。
在本示例中，我们可见测序数据“reads_1.fq”中的碱基质量几乎全部集中在低质量区域（红色区域），表明该数据测序质量较差。
Per sequence quality scores，横轴为reads碱基平均质量值，纵轴是reads数目。若测序质量越高，则绝大多数reads分布在高质量值区域，即曲线峰值的横坐标对应在高分区。
当峰值横坐标小于27（错误率0.2%）时报“WARN”，当峰值横坐标小于20（错误率1%）时报“FAIL”。
Per base sequence content，统计了测序碱基A、T、C、G的含量分布，可以一定程度上反映测序是否正常。图中横坐标为碱基在reads中的位置，纵坐标为该位置处各碱基含量百分比，根据碱基互补原则，A和T的比例应该接近，C和G的比例也应该是接近的。
实验过程所用的随机引物会引起前几个位置的碱基组成出现波动，这属于正常情况，或者可考虑将5'端前几个位置处的碱基统一裁剪去除。
当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过10%，报“WARN”；当任一位置的A/T比例与G/C比例相差超过20%，报“FAIL”。
所以看咱这个序列怎么这么奇怪呢，前面反而没有波动，后面咋回事？？？
Per sequence GC content，展示了测序reads的GC含量分布。图中横坐标为reads GC含量，纵坐标为reads数量；蓝色曲线为理想状态下的GC含量曲线（显著单峰），红色曲线为实际的GC含量曲线。
若红色曲线与蓝色曲线的拟合程度越高，则测数据序质量越好。曲线形状的偏差往往是由于文库的污染或是部分reads构成的子集有偏差（overrepresented reads），形状接近正态但偏离理论分布的情况提示我们可能有系统偏差，当红色出现双峰是表示混入了其它DNA序列。
偏离理论分布的reads超过15%时，报“WARN”；偏离理论分布的reads超过30%时，报“FAIL”。
你看这做的什么鬼东西？？？
Per base N content，当出现测序仪不能分辨的碱基时会产生N，该图统计了N碱基的含量分布。图中横坐标为碱基在reads中的位置，纵坐标为该位置处N碱基含量百分比，N碱基含量越低越好。
当任一位置N的比率超过5%报“WARN”，超过20%报“FAIL”。所以咱的基本是超过5%的，梅西了。
Sequence Length Distribution，统计了测序reads的长度分布，图中横坐标为reads长度，纵坐标是reads数目。
对于测序原始raw reads，每次测序仪测出来的长度在理论上应该是完全相等的；对于质控后的clean reads，由于切除测序接头、低质量碱基等后会导致长度出现波动，但就“好的测序数据”来讲，reads长度分布仍然集中在最长区域。
你看看你，这长度波动这么大，你想上天啊？
Sequence Duplication Levels，统计序列完全一致的reads的频率，判定为duplication reads（重复序列），由二代测序过程中PCR的偏好性扩增导致。一般测序深度越高，越容易产生一定程度的duplication reads，属于正常现象。图中，横坐标表示duplication的次数，纵坐标表示duplication reads的数目的百分比。理论上，duplication reads的比例越低越好。
当测序数据量很大时，使用全部数据计算duplication reads将相当费时，此时FastQC会选取数据中前200000条reads统计其在全部数据中的duplication reads情况，同时重复数目大于等于10的reads被合并统计。由于reads越长越不容易完全相同（由测序错误导致），所以其重复程度仍有可能被低估。
当duplication reads占总数的比例大于20%时，报“WARN”；当duplication reads占总数的比例大于50%时，报“FAIL”。
Adapter Content，统计测序reads两端接头序列（adapter sequence）长度所占比例，图中横坐标为碱基在reads中的位置，纵坐标表示该位置的碱基为测序接头序列碱基的百分比。
对于raw reads来讲，会存在一定比例的测序接头序列，需要过滤去除；而对于clean reads来讲，理论上测序接头序列应当已经被过滤干净。没有！看见没？这就是艺术！
参考
