前列腺癌是全球男性中常见的恶性肿瘤，尤其在进入去势抵抗性（CRPC）阶段后，治疗选择有限，预后较差。Wnt信号通路在肿瘤发生发展中扮演重要角色，但因其广泛参与正常生理过程，全面抑制常伴随严重毒性。因此，寻找在前列腺癌中特异性高表达、可靶向的Wnt通路组件，成为研究焦点。华盛顿大学泌尿外科和干细胞与再生医学研究所团队通过人激酶CRISPR敲除文库筛选结合多维度验证，揭示FZD6作为晚期前列腺癌高表达且高频扩增的Wnt受体，其靶向抑制可通过多重机制抑制肿瘤进展，并发现FZD6缺失与PKMYT1抑制剂的协同治疗潜力。海星生物（HySigen）依托自主研发的CRISPRSeek™文库筛选平台，提供高效、精准的CRISPR文库筛选服务，从文库设计、病毒包装到高通量测序及数据深度解析全流程赋能，助力科研人员快速挖掘肿瘤关键靶点与协同治疗策略。
一、核心研究方法
1.临床相关性评估体系
研究团队首先通过TCGA、SU2C/PCF等大规模前列腺癌基因组数据库，结合Gleason评分系统，对10种FZD受体的表达谱和遗传变异进行立体化分析。在细胞模型层面，采用qRT-PCR和RNA-seq技术检测了包括DU145（AR阴性）、C4-2B（AR阳性去势抵抗）、LN95（神经内分泌型）在内的6种前列腺癌细胞系，以及LuCaP系列患者来源异种移植（PDX）模型，覆盖腺癌、双阴性前列腺癌（DNPC）和神经内分泌前列腺癌（NEPC）等所有晚期亚型。
2.基因功能调控平台
为实现FZD6的可逆性调控，团队构建了Tet-On可诱导shRNA系统（pLKO-Tet-On），通过慢病毒感染实现多西环素（DOX）诱导的FZD6敲低。为验证特异性，还设计了shRNA抗性突变体（引入同义突变）进行挽救实验。选用人激酶sgRNA文库（涵盖763个激酶的3052条独立sgRNA），以MOI=0.3的低感染复数确保单基因敲除，通过MAGeCK算法进行稳健秩聚合（RRA）分析，精准识别协同致死基因（图5E）。此类筛选服务，海星生物HySigen亦可提供高质量的技术支持。
3.DNA修复功能检测组合
研究创新性地联用三种互补技术评估DNA双链断裂（DSB）修复能力：①免疫荧光动态追踪γH2AX焦点在依托泊苷处理后的清除动力学；②稳定整合DR-GFP和EJ5-GFP报告基因系统，分别定量同源重组修复（HR）和非同源末端连接（NHEJ）效率；③Western blot检测WEE1、ATM、XRCC1等修复蛋白表达变化。这种多参数评估体系确保了结论的可靠性。
4. 信号转导解析技术
采用反向蛋白芯片（RPPA）技术，用466种抗体进行全磷酸化蛋白质组扫描，快速锁定SRC、p-STAT3、p-AKT等关键节点。结合Western blot、免疫共沉淀（Co-IP）和细胞组分分离技术，阐明FZD6-PLK1-WEE1轴的调控关系。蛋白稳定性实验通过环己酰亚胺（CHX）追踪和蛋白酶体抑制剂MG132干预，揭示WEE1的翻译后调控机制。
5.治疗响应评估模型
在体外采用MTT和EdU掺入实验检测增殖抑制，通过IC50曲线评估药物敏感性。体内实验使用NOD/SCID小鼠建立LuCaP35CR（CRPC模型）和LuCaP176（DNPC模型）皮下移植瘤，采用DOX饮水给药实现FZD6诱导性敲低，联合顺铂（2.5mg/kg每3天）或PKMYT1抑制剂Lumesertib进行治疗，以肿瘤体积和生存期作为主要终点指标。
二、核心研究结果
结果1：FZD6在晚期前列腺癌中高表达且高频扩增
FZD6表达特征：在前列腺癌细胞系和PDX模型中，FZD6是表达量最高的Wnt受体之一，且在CRPC、DNPC、NEPC等多种晚期亚型中稳定表达（图1A、B）。
基因组变异特征：SU2C/PCF前列腺癌数据集显示，FZD6是所有FZD家族成员中扩增频率最高的基因（22%），显著高于其他FZD受体（图1C）。
临床相关性：FZD6表达水平与前列腺癌Gleason评分正相关，高表达与晚期前列腺癌不良临床结局显著关联（图1D-F）。
图1.FZD6在人类前列腺癌中高度表达和扩增，其表达与前列腺癌进展呈负相关
结果2：FZD6敲低抑制前列腺癌体外及体内生长
体外增殖抑制：在DU145（AR阴性）、C4-2B（AR阳性去势抵抗）、LN95（NEPC样）三种前列腺癌细胞中，FZD6敲低可抑制18.4%-34.3%的细胞生长，且回补shRNA抗性FZD6可逆转该效应，证实特异性（图2A-D）。
增殖机制：FZD6敲低通过降低EdU阳性细胞比例（抑制增殖）发挥作用，对细胞凋亡无显著影响（图2E）。
体内疗效验证：在LuCaP35CR（CRPC）和LuCaP176（DNPC）PDX模型中，FZD6敲低分别抑制50.4%和56.3%的肿瘤生长，且肿瘤细胞增殖指数（BrdU阳性率）显著降低（图2F-I）。
图2.FZD6敲低抑制前列腺癌生长
结果3：FZD6敲低损伤DNA双链断裂修复功能
基因表达特征：RNA-seq显示，FZD6敲低后，“DNA修复”“双链断裂修复”相关基因本体（GO）条目显著富集，DNA修复关键基因（POLE、ENDOV等）表达下调（图3A-C）。
DNA损伤累积：依托泊苷处理后，FZD6敲低的DU145和C4-2细胞中，γH2AX焦点（DSB标志物）清除延迟，平均焦点数分别增加2.4倍和3.4倍（图3D、E）。
修复通路抑制：DR-GFP和EJ5-GFP报告系统证实，FZD6敲低可分别抑制38.8%的同源重组（HR）和42.9%的非同源末端连接（NHEJ）修复活性（图3F）。
图3.FZD6敲低损害DNA损伤修复
结果4：FZD6通过SRC/STAT3和WEE1-PLK1通路调控肿瘤进展
下游信号通路鉴定：反向蛋白质阵列（RPPA）显示，FZD6敲低导致SRC、AKT1、STAT3活性降低，DNA损伤修复相关蛋白WEE1、ATM等表达下调（图4A）；Western blot验证该结果在多种前列腺癌细胞及PDX模型中均成立（图4B、C）。
增殖调控机制：过表达激活型SRC或STAT3可逆转FZD6敲低介导的增殖抑制，证实SRC/STAT3是FZD6调控增殖的关键下游通路（图4D）。
DNA修复调控机制：FZD6敲低通过蛋白酶体途径加速WEE1降解，过表达WEE1可逆转γH2AX焦点累积及HR/NHEJ修复缺陷（图4E-G）；PLK1敲低可阻断FZD6缺失诱导的WEE1下调，证实PLK1介导WEE1降解（图4I）。
图4.FZD6敲低通过WEE1减弱DNA损伤修复
结果5：FZD6敲低增强前列腺癌对化疗药及PKMYT1抑制剂的敏感性
与顺铂协同增效：在LuCaP35CR PDX模型中，FZD6敲低联合顺铂治疗，肿瘤体积较单独治疗组显著缩小（301.6 mm³vs 578.3 mm³/579.9 mm³），且显著延长小鼠生存期（图5A-C）；正常前列腺细胞RWPE对顺铂无协同敏感性，提示治疗安全性（补充图3B）。
WEE1抑制剂敏感性：FZD6敲低的DU145细胞对WEE1抑制剂AZD1775敏感性提升2倍（图5D）。
CRISPR文库筛选发现PKMYT1协同靶点：激酶CRISPR文库筛选显示，PKMYT1（WEE激酶家族成员）是FZD6敲低后细胞依赖性最强的激酶基因（图5F）；FZD6敲低细胞对PKMYT1抑制剂Lumesertib的敏感性提升11倍，证实两者协同效应（图5G）。
图5.FZD6敲低能使前列腺癌对顺铂和Lumesertib敏感
补充图3B.在不同浓度顺铂存在的情况下，表达无义序列和FZD6 shRNA的RWPE细胞的生存曲线通过MTT法测定
三、研究意义
本研究系统性地将FZD6确立为晚期前列腺癌的一个有前景的治疗靶点。它通过双轨机制促进肿瘤发展：一是驱动增殖，二是维护基因组稳定。靶向FZD6不仅能直接抑制肿瘤，还能通过削弱DNA修复能力，使肿瘤对基因毒性药物更加敏感。最具转化价值的是，通过CRISPR文库筛选，研究者发现了与FZD6构成合成致死关系的激酶PKMYT1。鉴于PKMYT1抑制剂Lumesertib已进入临床试验，本研究为将其与未来的FZD6靶向疗法联合应用，提供了令人信服的临床前证据。
海星生物可提供专为激酶功能研究设计的人激酶CRISPR 敲除文库，适用于人激酶的敲除和筛选。该文库靶向 763 个人激酶基因，包含 3052 个敲除载体，搭配 100 个对照载体，保障筛选可靠性。采用lentiGuide-Puro 骨架与辅助质粒 lentiCas9-Hygro 的双载体系统，gRNA 和 Cas9 基因分别位于两个载体上，建议先构建 Cas9 稳转株再转染 gRNA 文库，能显著提升敲除效率与实验效果，为肿瘤靶点挖掘、协同治疗筛选等研究提供高效工具支持。
参考文献：Li Y, Zhou Z, Zhang Y, et al. Targeting FZD6 creates therapeutically actionable vulnerabilities for advanced prostate cancer[J]. Oncogene, 2025: 1-10.
