用目的基因的CDS序列设计定量引物。
1、qPCR引物设计原则：
- 产物长度80-120bp，80-150bp最佳
- 引物长度18-25nt，F引物和R引物差别尽量不大于3bp
- 3'端尽量避免高GC/高AT含量区域
- 3'端最后一个碱基应为G/C，尽量避免...NNGC/...NNCG序列引物
- 正反向引物的Tm值最好相差不超1 ℃，引物Tm调整接近60℃
- GC含量为40-60%，4种碱基在引物中均匀分配
- 尽量避开G/C或者A/T的连续结构
- 尽量避免有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列存在
2、Primer Express software3.0软件
引物设计学习笔记.png
Primer Express 3.0主界面.png
参数设置.png
primer sequence.png
3、Primer premier 5 软件
File→New→DNA sequence→粘贴CDS序列→Primer→Search→设置参数（PCR product size：80-150 bp）
引物界面.png
