Complex interactions between potentially pathogenic,opportunistic, and resident bacteria emerge during infection on a reef-building coral

在造礁珊瑚的感染过程中，潜在致病性、机会性和常驻细菌之间出现复杂的相互作用

患病珊瑚上细菌多样性的增加会使疾病的病因学变得模糊，并使我们对发病机制的理解变得复杂。为了从微生物对疾病的反应中分离出可能导致白带病徵的微生物，我们给健康的珊瑚接种了来自明显患病珊瑚的感染剂量。我们对这些受剂量影响的珊瑚和健康对照进行了采样，以便对细菌16S区进行测序。内生虫单胞菌与4/10个菌落的健康样本有关，在给药前占据微生物群落的主导地位，而且只有在表现出疾病迹象的珊瑚中，内生虫单胞菌数量才会随着时间的推移而减少，这表明内生虫单胞菌在抵抗疾病方面发挥了作用。我们将与疾病相关的细菌按照数量增加的时间(初级细菌vs次级细菌)以及它们是来自剂量(殖民者)还是来自以前健康的珊瑚(反应者)进行分类。我们发现，不论最终的疾病状况如何，所有受剂量影响的珊瑚体内的初级反应者都有所增加，因此不太可能导致疾病迹象。相比之下，巴斯德氏菌科和Francisellaceae科的主要定殖菌仅在剂量较大的珊瑚中增加，这些珊瑚最终出现了疾病迹象，可能是与疾病迹象发育有关的外来感染性细菌。我们不再对患病和健康的细菌群落进行静态比较，而是提供了一个框架来识别其他珊瑚疾病中的关键角色。

关键词:

珊瑚疾病;白色带疾病;鹿角珊瑚;发病机理;共生微生物

简介

海洋无脊椎动物是一些最广泛研究和复杂细菌共生的家园。深海热液喷管蠕虫(Riftia pachyptila)缺乏口或内脏，而是从含有化学自养细菌的特殊器官获取营养。短尾乌贼Euprymna scolopes还为其细菌共生菌fischeri开发了一种特殊的器官，使其能够发出生物荧光。随着我们更多地了解这些互惠关系，我们也更好地理解病原体和有益共生体之间的连续性。理论认为一些有益的细菌最初可能是病原体，随着宿主的进化而增强宿主的适应性。最近，深海贻贝硫氧化有益共生体的基因组被发现含有编码毒力基因的毒素同源体，使我们对病原体和毒力的认识复杂化。近年来，所描述的海洋疾病及其影响的数量迅速增加，导致了关键海洋生态系统的崩溃。动物流行病增加的部分原因可能是由于人为因素和气候变化导致海洋细菌-动物关系的变化。由于农业径流和向藻类占主导地位的生态系统的转变，沿海海洋生态系统和周围海水日益饱和，微生物从气温上升和可用营养物质增加中获利。这种微生物丰富度的增加，加上以前良性细菌的行为和基因调节变化，对疾病和共生有了明确的定义。为了了解并最终控制这些新的外生动物，我们需要研究与海洋动物有关的细菌群落是如何变化的，作为疾病的起因和对疾病的反应:在有益的、互惠的和致病的关系之间进行转换。
白带病(WBD)是一种传染性疾病，目前已导致两种加勒比顶孔珊瑚种群大量死亡。顶孔珊瑚是一种生长迅速的造礁珊瑚，为许多鱼类和无脊椎动物(包括生长较慢的珊瑚)创造了栖息地。WBD的特征是坏死组织的前部，从珊瑚群的基部到顶端迅速移动，留下一条带白色的骨骼。WBD可通过水柱和珊瑚虫传播。多项研究证实，WBD征象可能是由疾病浆液中的细菌部分引起，并通过抗生素的给药而抑制，提示该病是由细菌引起的。研究表明，charchariae弧菌能够在波多黎各的a . cervicornis中诱发WBD信号，而一种可能危及宿主的类似立克次氏体的有机体，与表面上健康的a . cervicornis和表现出疾病信号的a . cervicornis都有关联。这些细菌和其他细菌如何促进WBD症状的发展，以及是否在整个加勒比地区和整个时间内存在一种单一的主要WBD病原体，目前尚不清楚。白带病(WBD)是一种传染性疾病，目前已导致两种加勒比顶孔珊瑚种群大量死亡。顶孔珊瑚是一种生长迅速的造礁珊瑚，为许多鱼类和无脊椎动物(包括生长较慢的珊瑚)创造了栖息地。WBD的特征是坏死组织的前部，从珊瑚群的基部到顶端迅速移动，留下一条带白色的骨骼。WBD可通过水柱和珊瑚虫传播。WBD可通过水柱和珊瑚虫传播。多项研究证实，WBD征象可能是由疾病浆液中的细菌部分引起，并通过抗生素的给药而抑制，提示该病是由细菌引起的。多项研究证实，WBD征象可能是由疾病浆液中的细菌部分引起，并通过抗生素的给药而抑制，提示该病是由细菌引起的。研究表明，charchariae弧菌能够在波多黎各的a . cervicornis中诱发WBD信号，而一种可能危及宿主的类似立克次氏体的有机体，与表面上健康的a . cervicornis和表现出疾病信号的a . cervicornis都有关联。这些细菌和其他细菌如何促进WBD症状的发展，以及是否在整个加勒比地区和整个时间内存在一种单一的主要WBD病原体，目前尚不清楚。
Gignoux-Wolfsohn和Vollmer(2015)利用16S基因序列发现wwd相关菌群与健康珊瑚有显著差异。与其他珊瑚疾病的研究结果一致，我们发现有疾病迹象的珊瑚的细菌群落更加多样化，与明显健康的珊瑚相比，与OTUs的联系更加紧密。缺乏持续健康的相关细菌表明，其他因素可能会削弱这种微生物群。我们还发现，采集地点对微生物群落的影响与珊瑚的不稳定状态一样大。在所有位点中发现的许多与疾病相关的OTUs成为许多假定的WBD病原体。
细菌性疾病可能是由单个病原体的几个细胞侵入宿主组织(低感染剂量)引起的，这是一个病原体联合体，它可能足以但并非必须引起疾病症状或通常共生的细菌达到阈值，从而引发向致病性行为的转变。此外，共生细菌可能由于外部环境的触发而致病。围绕这些情景中的哪些导致类似感染性WBD的迹象的不确定性使得我们确定哪些识别的“疾病相关”OTU可能侵入宿主组织并引起疾病体征并且可能对坏死有反应的能力变得复杂，宿主免疫应答或病原体产生的次级代谢产物。我们在三个时间点，将病珊瑚及样本珊瑚的组织均质化，并以感染剂量照射珊瑚:(i)照射前表面健康;(ii)照射后表面健康;通过使用多个珊瑚菌落，我们能够更好地识别与每个菌落相关的寄生微生物，并且通过在受控的容器中进行这个实验，我们消除了致病性的环境诱因的可能性。通过使用多个珊瑚菌落，我们能够更好地识别与每个菌落相关的寄生微生物，并且通过在受控的容器中进行这个实验，我们消除了致病性的环境诱因的可能性。我们检查了疾病相关的OTUs在两个站点之间的一致性，以消除我们之前发现的站点变异性。这个受控的感染实验让我们能够回答关于患病的珊瑚微生物群的两个主要问题:(i)这些疾病相关的细菌从何而来?(二)什么时候它们的数量会增加?我们预计最终的病害珊瑚微生物群落将由来自于剂量(这里称为定殖器)的细菌和在珊瑚(应答者)上发现的细菌的丰度增加而形成，这些细菌在病征发生前(原发)或发生后(继发)大量增加。

材料和方法

2014年7月，在巴拿马博卡斯德尔托罗（位于佛罗里达州）珊瑚礁的两个地点（CK4和CK14）使用鹿角珊瑚（Acropora cervicornis）建立了感染实验。在每个地点，通过采集来自5个菌落的12个明显健康的5厘米碎片（假定为不同的基因型，至少相距10米）的A. cervicornis，共收集10个菌落（菌落）来收集珊瑚。通过从表现出WBD迹象的3个菌落的疾病界面（或等同位置）和来自三个明显健康的对照菌落的三个重复的5cm片段收集待制成接种物的珊瑚。这些碎片被送往史密森热带研究所，并被绑在塑料百叶窗上。将10个片段(每个菌落1个片段)放置在12个带动力头的封闭50 L罐(罐)中(实验设计见图S1支撑信息)。珊瑚是采样时放置在水箱(时间)在以下方式:两个息肉的中间片段(这个小示例使用,以免压力珊瑚碎片)被用无菌钳和放置在200年μl硫氰酸胍DNA的缓冲区。镊子在珊瑚之间用火焰消毒。在整个实验过程中，为了保持盐度和体积，加入了去离子水，并测量了温度，以确保水箱间的一致性。创建12菌剂(三个剂量和三个控制菌剂从每个站点),三个复制碎片从每个殖民地被摇晃的猎鹰管无菌均质玻璃珠和15毫升过滤海水,直到没有组织保持骨架,然后汇集。二百毫升的变质剂是离心机和保存500年μl DNA的缓冲区。在接种之前，使用喷枪和过滤的海水损坏珊瑚。然后用6mL剂量（接种剂的剂量水平）接种6个罐，每个位点接种3个（接种部位），并且用60mL对照接种物（接种物的对照水平）接种6个罐，每个位点3个（接种物）现场）。然后如上所述在接种后10小时对珊瑚取样（时间二）。当接种后22小时开始给药珊瑚开始显示疾病迹象（即白色病变生长环绕珊瑚并形成特征性白色骨架）时，将它们取样并从实验中移除以及相应的对照片段（时间三）。以这种方式继续取样，直至接种后60小时，对所有剩余的珊瑚进行取样（参见图S1进行取样）。根据珊瑚是否最终显示出疾病迹象来确定珊瑚的最终疾病状态。例如，即使在时间2收集的样本来自看起来很健康的珊瑚，如果珊瑚在第3时显示出疾病迹象，那么样本的最终疾病状态就会患病。 60只珊瑚中共有43只最终出现疾病迹象。 60只对照珊瑚中的两只在实验过程中死亡，并从后续分析中删除（表S1，支持信息）。
使用Agencourt DNAdvance珠提取试剂盒从样品中提取DNA，并添加PEB缓冲液。每轮进行空白DNA提取。选择16S基因的V6高变区作为靶标，因为其长度短，对物种水平多样性具有高度敏感性。V6区域用引物扩增，该引物由与V6互补的区域，独特的5碱基对条形码和Illumina测序接头组成：V6-L [5′ ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTnnnnnCW ACGCGARGAACCTTACC3 ′]
V6-R [5′ CGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCTnnn nnACRACACGAGCTGACGAC3 ′]
使用独特的引物组合对每个样品进行单独的40μlPCR反应：每种4mM引物5μl，8μl标准Taq缓冲液（New England Biolabs，Ipswich，MA，USA），0.8μldNTP，20μldH2 O， 0.5μlTaqDNA聚合酶（NEB）用于以下循环：94°C持续2分钟，28个循环94°C持续15 s，55°C持续15 s，72°C持续30 s，以72°C结束1分钟用每组反应扩增阴性对照和空白。使用Qubit 2.0荧光计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）定量PCR产物的浓度，以确定每种产物的体积。然后用以下Illumina引物扩增合并的PCR产物：OLJ139 [5′ AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTA CACGA3 ′]
OLJ140 [5′ CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCC TGCTGAAC3 ′]

生物信息学

使用FLASH重叠配对读数（Magoc和Salzberg 2011）。然后使用https://github.com/sagw/Python scripts / blob / master / SD1 / SD1 demultiplex.py上提供的自定义python脚本对序列进行多路分解，质量过滤和修剪。
使用Qiime 1.9.0，使用开放参考OTU拣选方法和使用BLAST针对2015年7月SILVA数据库分配的分类法挑选97％OTU（Quast等人2013）。使用BLAST鉴定为叶绿体的OTU被除去。使用UCHIME检测并除去嵌合体（Edgar等人，2011）。有关生物信息学的更多详细信息，请访问https://github.com/sagw/Notebooks/tree/master/SD1笔记本。

统计分析

OTU计数在R包DESeq2中使用sizefactors方法进行归一化，使用算术方法进行归一化。使用Bray-Curtis异质性的PERMANOVA (package Vegan中的adonis)测试社区水平效应的意义。
两个PERMANOVAs进行:一个使用公式:‘∼ colony’ for time-one samples, and one using the formula: ‘∼ fi- nal disease state + inoculant ∗ site ∗ time ∗ inoculant site’对于时间点两的三个样本。
为了评价各主要效应之间的单个OTU的丰度变化以及随机效应的加入对相互作用的影响，将各OTU的丰度数据拟合到拟泊松混合效应广义线性模型中。
GLMMs时间一样品用固定效应公式：使用Wald卡方检验(pack- age Car的方差分析)(Fox和Weisberg 2011年的方差分析)通过III型方差分析确定效应的显著性，并对每个主要效应和交互作用确定显著差异的OTUs (p值通过错误发现率调整< 0.05)。然后根据GLMM项的显著性和事后计算均值对OTUs进行分组，使用ggplot2绘制OTUs子集的平均丰度。

OTU组定义

我们鉴定出有菌落特异性的健康菌群为OTUs，它们在第一时间因菌落的不同而显著不同，在第二次和第三次因疾病状态的不同而显著不同，其丰度控制高于受剂量影响的病珊瑚。这些OTUs大部分属于内生菌属，因此，对每个菌落计算每个被鉴定为内生菌的OTU的平均值，并将每个菌落样品中内生菌占总菌群的百分比作为内生菌组成的百分比的平均值。
我们确定了可能与疾病病因有关的细菌(原发性OTUs)，这些OTUs在珊瑚上大量增加，最终在这些症状出现之前就显示出疾病迹象。我们假设暴露于感染剂量但没有显示疾病迹象的珊瑚对疾病具有抵抗力(即减少病原体载量或禁止感染)，因此可能在其微生物群落中不包含与疾病病理有关的OTUs。因此，我们把重点放在了OTUs上，这些OTUs在剂量充足的珊瑚中含量更高，最终显示出疾病迹象。
如果他们（i）没有剂量，我们将OTU确定为主要应答者; （ii）及时出现一只珊瑚; （iii）最终疾病状况在时间上显着不同 - 两个和三个珊瑚; （iv）在给药的患病珊瑚中比对照更丰富; （v）在菌落，位点或位点和接种物的相互作用方面没有显着差异。如果OTUs (i)在剂量中没有出现;(ii)曾经有过珊瑚;(iii)最终病况在时间二和三上有显著差异;(iv)受剂量影响的病珊瑚数量多于对照组;且(v)在菌落、位点或位点与接种物的相互作用上无显著差异，我们确定OTUs为主要应答者。
如果（1）剂量比对照孕育剂更丰富; （ii）最终疾病状态显着不同; （iii）在两次和三次时，对照珊瑚的剂量较大; （iv）菌落，位点和孕育剂和接种部位的相互作用没有显着差异，我们将OTU鉴定为主要定殖者
次生OTUs在最终的疾病状态上有显著的差异，与对照组相比，在第三次而不是第二次用药时，染病的OTUs数量更多。这些OTUs按科进行分组，并计算出在三次按地点和接种地点分开显示疾病迹象的剂量珊瑚的平均值。
所有序列都存储在bioproject ID PRJNA387312下的Read Archive中。分析的进一步细节可以在https://github.com/sagw/r -scripts/tree/master/SD1找到

结果与讨论

我们确定了数量不断变化的OTUs群，这有助于形成典型的患病珊瑚微生物群:与某些珊瑚菌落相关的常驻OTUs(菌落特异性居民)减少，其他常驻OTUs(主要应答者)增加，以及外来细菌的定植(主要定植者)。这种识别海洋动物从健康到可见疾病迹象转变过程中细菌群的方法可以应用于其他未被充分研究的海洋疾病。

社群水平的影响

对275个样本进行测序，得到65 413 553个重叠读序列，得到97 933个OTUs(97%相似度)。注射处理后的珊瑚的细菌群落变得更加多样化,因为他们表现出疾病症状的香农多样性(从2.13,0.12到4.18,0.19,方差分析,F1, 272 = 52.37, P < 0.001)和稀薄的丰富性(从224.43到402.57,方差分析,F1,272 = 27.95, P < 0.001)(表S2,支持信息)。这一发现与其他关于珊瑚疾病相关细菌群落的研究一致。
在给药前(第一次)收集的样本中，细菌群落之间的差异很大(18%)可以用菌落的显著效应来解释(PERMANOVA, F9,81 = 1.8, P = 0.001, R2 = 0.18)。对于给药后采集的样本(2次、3次)，最终疾病状态的主要影响，以及时间、接种剂和接种位点的相互作用，显著影响珊瑚相关菌群(表1)。

内游动单胞菌是健康珊瑚的菌落特异性宿主

不同地点的次级OTUs不一致

结果

患病珊瑚的微生物群落取决于已存在的健康微生物群落、受感染珊瑚的疾病史、疾病的起源和疾病进展的时间。我们的方法允许我们根据细菌数量增加的来源和时间来分离细菌，提供了比以前独立培养的研究更多的关于细菌可能导致疾病的信息。我们的研究发现，内生单胞菌只与某些珊瑚群落的健康有关，这可能解释了个别珊瑚对疾病反应的变化。主要反应者，可能是机会主义者，无论最终的疾病状态如何，都会增加剂量的珊瑚，这一发现否定了一种假说，即颈角顶孔鸟的WBD并不仅仅是机会主义者造成的。我们确定了源自感染剂量的主要定植体，并能够密切跟踪其数量的变化，因为珊瑚出现了疾病迹象，确定弯曲杆菌科、弗朗西斯菌科和巴氏杆菌科是最可能的主要病原体。我们的研究结果强调了将时间纳入未来海洋疾病研究的重要性，以及观察单个菌株行为的必要性，而不是仅仅通过更高层次的分类来总结群落的变化。我们的方法可以应用于不属于一种病原体一种疾病框架的其他海洋疾病，提供对疾病的更全面的理解，并允许在我们不断变化的海洋气候中改变病原体的定义。