背景介绍
1. Pb1是一个稻瘟病抗性基因，可以使水稻对稻瘟病表现较强的抗性。
2. Pb1编码一个CC-NBS-LRR蛋白，但是Pb1并没有P-loop，并且其他的几个R蛋白保守的motif也发生退化，暗示Pb1可能有不同的机制。
3. 有研究表明，一些R蛋白的核定位或者细胞质到细胞核的转运对其功能的行使非常重要。
4. SA在植物系统获得性免疫过程中发挥重要作用。在水稻SA信号通路中，WRKY45发挥重要作用。
科学问题
本文对Pb1增强稻瘟病抗性的分子机制进行了解析，发现了Pb1和SA信号通路之间的crosstalk。
主要结论
1. Pb1的CC domain可以和WRKY45发生互作
1）之前有研究报道，R蛋白的CC domain可以和WRKY转录因子互作。受此启发，本文对Pb1和是否也能和WRKY蛋白家族成员互作进行了检测。
2）作者挑选了不同家族的WRKY转录因子，通过酵母双杂系统发现，只有WRKY45会和Pb1-CC发生互作，并通过GST-pull down，Co-IP以及 split LUC系统进行了验证。
3）通过预测及定点突变，发现了四个疏水氨基酸影响Pb1-CC和WRKY45的互作。
新问题：Pb1-CC和WRKY45互作，对Pb1介导的稻瘟病抗性有什么影响呢？
2. Pb1介导的稻瘟病抗性依赖于WRKY45
1）WRKY45转录和蛋白水平都和稻瘟病抗性正相关
2）在Pb1+或者Pb1OX背景下knock down WRKY45，会使稻瘟病抗性降低
3）过表达影响和WRKY45互作的位点突变的Pb1（Pb1-Quad），稻瘟病抗性增强效果减弱
3. Pb1的核定位是增加稻瘟病抗性必须的
1）GFP-Pb1在细胞核和细胞质中都有定位，WRKY45-GFP定位在细胞核中。并通过核质分离实验对Pb1的亚细胞定位进行了验证。
2）Pb1的核定位对其功能是不是必须的？
构建了HA-Pb1-NES载体，转化植株发现，稻瘟病抗性减弱
3）既然Pb1的核定位那么重要，稻瘟菌侵染会改变其亚细胞定位吗？
并不会！
原文没有回答的问题：Pb1的胞质定位是不是也是其增强稻瘟病抗性所必须的？
4.Pb1介导的稻瘟病抗性部分依赖于SA通路
WRKY45是SA通路中的重要组分，Pb1介导的稻瘟病抗性和SA有什么关系吗？
在Pb1OX背景下过表达SA降解蛋白NahG，会降低稻瘟病抗性，说明Pb1介导的稻瘟病抗性部分依赖于SA通路。
5.Pb1抑制ubiquitin蛋白酶体对WRKY45的降解
1）在使用小麦胚芽提取物系统表达WRKY45蛋白时，添加MG132增加WRKY45蛋白表达量，说明WRKY45会被ubiquitin蛋白酶体降解
2）WRKY45和Pb1共表达也会增加WRKY45蛋白含量，暗示Pb1可能会抑制UBQ对WRKY45的降解，增加其稳定性。由于小麦胚芽提取物是外源表达系统，在水稻中是不是也是这样呢？
3）将WRKY45和Pb1在水稻原生质体中共表达，也会增加WRKY45的含量，并且随着Pb1蛋白的增加，WRKY45也增加。
问题：Pb1稳定WRKY45是直接的还是间接的？和他俩互作有无关系？
4）Pb1-Quad和Pb1-NES对WRKY45的稳定效果减弱，说明Pb1通过和WRKY45互作直接稳定WRKY45蛋白。
技术方法
水稻核质分离
小麦胚芽提取物体外翻译系统
体外Co-IP
Take Home Message
1）对于一些生物体内容易降解或表达量低的蛋白，可以分别进行体外翻译，得到纯化蛋白后，再进行体外的孵育和Co-IP实验。
2）WRKY45一直有双带，和Pb1共表达时，下面的条带变弱，文章并没有对这一现象进行解释。
3）R蛋白易降解，表达量低，不容易检测到。把标签放在R蛋白的N端和C端对R蛋白的检测及功能有没有影响？
