2026年3月17日，陆军军医大学师超峰博士为第一作者，刘晋祎教授、陈卿教授、曹佳教授为共同通讯作者，在《Journal of Advanced Research》期刊发表题为“The m6A modification mediates the imbalance of mitochondrial homeostasis and apoptosis induced by Benzo[b]fluoranthene in mouse spermatocytes: mitophagy versus mitochondrial damage”科研论文。研究系统揭示环境污染物苯并[b]荧蒽（Benzo[b]fluoranthene, BbF）通过介导m6A修饰变化影响线粒体稳态失衡，从而诱导小鼠精母细胞线粒体功能障碍和凋亡的分子机制。易基因科技为本研究提供MeRIP-seq和RNA-seq技术服务，助力揭示BbF通过m6A修饰双向调控线粒体命运诱导精母细胞凋亡新机制。
研究发现， BbF暴露一方面通过下调m6A阅读蛋白（reader）YTHDF2，维稳Trp53 mRNA，且激活p53/PGC-1α/TFAM信号轴，进而导致精母细胞线粒体生物发生损伤、功能障碍和凋亡。另一方面，细胞启动一种保护性补偿机制（上调m6A甲基转移酶METTL3），增强Mark4 mRNA的m6A修饰，进而激活PINK1/Parkin介导的线粒体自噬以清除受损线粒体以减轻细胞损伤。本研究阐明了m6A修饰在BbF诱导的精母细胞线粒体稳态失衡中的双向调控作用，揭示了“损伤”与“保护”通路共同决定细胞命运。
英文标题：The m6A modification mediates the imbalance of mitochondrial homeostasis and apoptosis induced by Benzo[b]fluoranthene in mouse spermatocytes: mitophagy versus mitochondrial damage
译文标题：m6A修饰介导苯并[b]荧蒽诱导的小鼠精母细胞线粒体稳态失衡与凋亡：线粒体自噬vs线粒体损伤
发表时间：2026年3月17日
发表期刊：Journal of Advanced Research（JAR）
影响因子：IF13/Q1
技术平台：MeRIP-seq/m6A-seq、RNA-seq（易基因金牌技术）
作者单位：陆军军医大学
DOI:10.1016/j.jare.2026.03.031
易小结
本研究从表观转录组学视角，深入阐明环境污染物BbF导致男性生殖损伤的分子机制，为理解化学物暴露诱导的线粒体稳态失衡提供了全新调控网络。
本研究采用的m6A-seq和RNA-seq技术（易基因金牌产品），为精准识别环境污染物暴露下的关键表观转录调控靶点提供了强大工具，为未来相关领域（如生殖毒理学、环境健康科学）的研究提供了新思路和技术参考。
研究方法
（1）体内外模型构建
体内：6周龄SPF级ICR雄性小鼠，通过灌胃给予BbF（0、8、20、50mg/kg）连续35天，建立暴露模型。
体外：小鼠精母细胞系GC-2，给予不同浓度BbF（20、40、80μM）处理，并利用多种抑制剂（如PFT-α、CsA、3-MA）和激活剂（ZLN005）进行机制验证。
（2）表型与功能分析
凋亡检测：TUNEL染色（睾丸组织）、CCK-8（细胞活力）、流式细胞术（Annexin V/PI）。
线粒体功能与形态：ATP含量、线粒体膜电位（JC-1）、活性氧（ROS）检测、透射电镜（TEM）观察线粒体超微结构及自噬体、mtDNA拷贝数测定。
分子表达：Western Blot和qPCR检测相关蛋白（p53/PGC-1α/TFAM/BCL-2/ BAX/Cleaved Caspase-3/PINK1/Parkin/LC3B/p62/METTL3/YTHDF2/MARK4）及mRNA水平。
细胞功能：构建Ythdf2过表达（Ythdf2-OE）、Mettl3敲低（sh-Mettl3）的GC-2稳转细胞系，使用siRNA敲低Mark4。
（3）多组学测序分析
转录组测序（RNA-seq）：对对照组和高剂量BbF暴露组小鼠睾丸组织进行测序，筛选差异表达基因（DEGs），并进行GO、KEGG、GSEA富集分析，锁定氧化磷酸化等关键通路。
m6A甲基化测序（m6A-seq）：对相同分组的睾丸组织进行m6A-seq，鉴定差异m6A修饰峰，分析其分布特征（如富集于3’UTR）和motif序列（RRACH）。将m6A修饰上调基因集与转录组DEGs取交集，筛选METTL3潜在靶基因（Mark4）。
（4）m6A修饰功能验证
RIP-qPCR：验证YTHDF2蛋白与Trp53 mRNA的结合。
MeRIP-qPCR：验证METTL3对Mark4 mRNA特定位点的m6A修饰增强。
mRNA稳定性实验：qPCR分析Trp53和Mark4 mRNA的降解速率，验证YTHDF2和METTL3通过m6A修饰调控其靶mRNA稳定性功能。
研究结果
（1）BbF通过p53/PGC-1α/TFAM信号通路诱导线粒体损伤和精母细胞凋亡
研究首先在体内外证实了BbF的生殖毒性。体内实验显示，BbF暴露增加了小鼠睾丸组织中精母细胞凋亡（图1A）。体外实验中，BbF剂量依赖性降低了GC-2细胞活力并增加凋亡率（图1B-D），同时下调抗凋亡蛋白BCL-2和上调促凋亡蛋白BAX、p53和Cleaved Caspase-3（图1E-F）。
为探究深层机制，研究团队对睾丸组织进行转录组测序（RNA-seq）分析，揭示BbF显著影响氧化磷酸化通路。后续验证发现，BbF暴露降低了线粒体生物发生关键调控因子PGC-1α及其下游靶点TFAM的mRNA和蛋白表达（图2A-B、F-G），导致mtDNA拷贝数下降（图2C- D、H）、ATP含量减少、线粒体膜电位降低、ROS水平升高。透射电镜（TEM）图像直观显示了线粒体肿胀、嵴消失等损伤形态（图2E）。这些结果系统证明p53/PGC-1α/TFAM信号轴是BbF诱导精母细胞线粒体损伤和凋亡的关键通路。
图1：BbF诱导精母细胞凋亡
图2：BbF诱导精母细胞线粒体损伤
（2）精母细胞中诱导PINK1/Parkin相关的保护性线粒体自噬
鉴于线粒体功能障碍常伴随线粒体自噬发生，研究团队对此进行了探究。透射电镜观察发现，BbF处理组小鼠睾丸精母细胞中出现自噬溶酶体样结构（图2E）。免疫荧光共定位显示，BbF处理增加了GC-2细胞中线粒体与自噬标志物LC3B的共定位水平（图3A-B）。Western blot结果显示，BbF处理上调了PINK1和Parkin蛋白水平及LC3-II/LC3-I比值，同时下调了自噬底物p62表达（图3C-D），这共同表明线粒体自噬被激活。使用线粒体自噬抑制剂CsA或3-MA进行干预，发现抑制线粒体自噬会进一步加重BbF诱导的细胞凋亡，证明BbF暴露所激活的PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，是一种试图拮抗损伤、维持细胞存活的保护性补偿机制。
图3：BbF暴露模型中线粒体自噬被激活
（3）m6A修饰调控调节BbF诱导的精母细胞线粒体稳态失衡和凋亡
为从表观转录组角度分析上述过程的调控机制，研究对对照组和高剂量BbF暴露组的小鼠睾丸组织进行m6A甲基化测序（m6A-seq）。测序结果鉴定出744个m6A修饰上调基因和1381个修饰下调基因（火山图）（图4A）。这些差异m6A修饰peaks主要富集在mRNA的3’非翻译区（3’UTR）（图4B-D），且其核心motif符合经典的RRACH序列特征（图4E）。对差异m6A修饰基因的GO和KEGG富集分析发现，这些差异修饰基因与线粒体功能、细胞凋亡等通路密切相关（图4F-K），证明m6A修饰在BbF毒性过程中的重要作用。
图4：BbF暴露后小鼠睾丸组织的m6A-seq
（4）YTHDF2通过介导Trp53 mRNA降解参与调控BbF对精母细胞的毒性作用
通过分析公共数据库中生殖细胞特异性Ythdf2敲除小鼠的转录组数据，发现其睾丸组织中p53编码基因（Trp53）表达显著上调，提示YTHDF2缺失可能导致p53积累。为此，研究团队构建了Ythdf2过表达的GC-2稳转细胞系。结果显示，过表达Ythdf2能有效拮抗BbF引起的细胞凋亡，并逆转BbF对PGC-1α、TFAM表达抑制，提升mtDNA拷贝数和ATP含量。机制上，BbF暴露上调了Trp53 mRNA和p53蛋白水平，而过表达Ythdf2则降低二者表达。RIP-qPCR实验证实YTHDF2蛋白可与Trp53 mRNA直接结合。最关键的是，mRNA稳定性实验证明，BbF暴露减缓Trp53 mRNA的降解速率，而过表达YTHDF2则加速其降解。这些结果完整揭示YTHDF2下调如何通过减缓Trp53 mRNA降解，导致p53蛋白累积，进而驱动p53/PGC-1α/TFAM介导的线粒体损伤与凋亡。
（5）保护性响应：METTL3上调在减轻细胞损伤中发挥关键作用
为研究METTL3上调的作用，研究团队构建了Mettl3敲低的GC-2稳定细胞株（sh1-Mettl3, sh2-Mettl3）。结果显示，与sh-NC+BbF组相比，Mettl3敲低后再暴露于BbF，细胞活力进一步下降、凋亡率增加、BCL-2下调、BAX和Cleaved Caspase-3上调，且ATP含量也显著降低（图5D-I），揭示BbF暴露背景下，敲低METTL3会导致更严重的细胞损伤。上述研究结果表明BbF诱导的METTL3上调实际上起到了保护细胞、促进生存的作用。
图5：BbF暴露背景下，METTL3上调对细胞发挥保护作用
（6）METTL3/MARK4介导精母细胞中保护性线粒体自噬发生
为寻找METTL3的下游靶点，研究团队将RNA-seq鉴定的差异表达基因（916个）与m6A-seq鉴定的m6A修饰上调基因集（744个）进行交集分析，筛选出26个METTL3的潜在靶基因（图6A-B）。根据其分子功能和表达谱，对Mark4、Ube2v1和Creb3l1进行验证。实验证实，BbF暴露会上调Mark4的mRNA和蛋白水平，而敲低Mettl3则会抑制这种上调（图6I-J）。m6A-seq和MeRIP-qPCR验证了METTL3介导了Mark4 mRNA的m6A修饰水平升高（图6K-L）。RNA稳定性实验表明，METTL3通过增强m6A修饰，显著延长Mark4 mRNA半衰期（图6M-O）。功能实验表明，敲低Mark4会逆转BbF诱导的线粒体自噬（PINK1、Parkin、LC3B-II/LC3B-I减少，p62增加），并加剧细胞凋亡（图7C-I）。同样，敲低Mettl3也表现出类似的抑制线粒体自噬和加剧凋亡表型（图7J）。由此，本研究确立了METTL3/MARK4信号轴通过激活PINK1/Parkin相关的保护性线粒体自噬，在BbF暴露下发挥细胞保护作用
图6：BbF暴露模型中METTL3介导Mark4的m6A修饰上调，从而降低其RNA降解速率。
图7：METTL3/MARK4介导精母细胞中线粒体自噬发生，并在部分减轻细胞损伤中发挥作用
结论和启示
本研究通过整合体内/外模型、表观转录组（m6A-seq）和转录组（RNA-seq）及多层次功能验证研究，揭示了BbF暴露通过下调YTHDF2，激活p53/PGC-1α/TFAM信号轴，诱导精母细胞线粒体损伤和凋亡；同时细胞通过上调METTL3，增强Mark4 mRNA的m6A修饰，激活PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，发挥保护作用。m6A修饰介导的“损伤”与“保护”通路失衡，最终导致线粒体稳态破坏和细胞凋亡。
m6A-seq的重要作用
本研究充分展示m6A-seq在探索环境毒理学机制中的重要作用。m6A-seq不仅能够全转录组范围内描绘暴露后的m6A修饰谱，还通过与转录组测序的整合分析，高效、精准地锁定关键的下游靶基因（如本研究的Mark4），为深入揭示复杂的调控网络提供关键线索。未来的类似研究可以借鉴此策略，结合多种组学数据，从多维度解析毒性作用机理。
参考文献：Shi CF, Han F, Jiang X, Sun L, Liu KL, Sun SQ, Li YQ, Wang JK, Ao L, Cao J, Chen Q, Liu JY. The m6A modification mediates the imbalance of mitochondrial homeostasis and apoptosis induced by Benzo[b]fluoranthene in mouse spermatocytes: mitophagy versus mitochondrial damage. J Adv Res. 2026 Mar 16.doi: 10.1016/j.jare.2026.03.031.
