作者，Evil Genius

接下来为我们的生化小课，CADD计算机辅助药物设计，分子对接/分子动力学做好准备，今日参考文献，单位是复旦大学的，一篇十几分的文章在手，大家羡慕不？我是羡慕的不行，当初没好好学习，进不去好的单位，真有点后悔。

知识积累

抗体偶联药物（antibody-drug conjugates，ADCs）已经改变了HER2阳性乳腺癌的治疗格局。

利用成像质谱流式技术（imaging mass cytometry），对FASCINATE-N临床试验中接受 SHR-A1811 治疗的47例HER2阳性/激素受体阴性乳腺癌患者进行了空间蛋白组学分析，共分析了157个感兴趣区域（ROI）和912,360个单细胞。

空间蛋白组学分析发现了影响ADC治疗反应的两个关键因素：

肿瘤细胞H3K27ac表达升高与更好的ADC治疗效果相关，提示H3K27ac可能是预测ADC疗效的潜在生物标志物。

胶原蛋白阳性的成纤维细胞（collagen-positive fibroblasts）与ADC耐药相关，提示肿瘤间质及其形成的物理屏障可能限制ADC发挥作用。

进一步研究发现，在临床前模型中，将ADC分别与组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDAC inhibitor）chidamide或胶原蛋白调节药物losartan联合使用，可以产生协同抗肿瘤作用。

这些生物标志物和潜在治疗策略随后在接受曲妥珠单抗德鲁斯特安（trastuzumab deruxtecan，T-DXd）治疗的晚期HER2阳性患者中得到独立验证。

此外，根据上述空间特征建立了一个具有临床应用潜力的ADC屏障预测模型，并且可以通过多重免疫荧光（multiplex immunofluorescence）进行检测和实施。

总结：研究揭示了影响ADC疗效的关键空间微环境因素：肿瘤细胞H3K27ac升高有利于ADC治疗，而胶原蛋白阳性成纤维细胞形成的肿瘤间质屏障可能促进ADC耐药。同时，HDAC抑制剂和胶原调节策略可能成为克服ADC耐药的联合治疗方案。

人表皮生长因子受体2阳性（HER2+）乳腺癌约占所有乳腺癌病例的 15%–20%，其特点是侵袭性强、预后较差。自20世纪90年代末曲妥珠单抗（trastuzumab）获批以来，HER2靶向治疗已经从最初的单克隆抗体和酪氨酸激酶抑制剂（TKIs），逐渐发展到目前的抗体偶联药物（antibody-drug conjugates，ADCs）。ADCs将抗体的精准靶向能力与强效细胞毒性药物相结合，在HER2+乳腺癌中表现出显著的治疗效果。此外，随着连接子（linker）优化和有效载荷（payload）选择技术不断进步，ADC药物的研发水平也得到进一步提升。这些优势凸显了ADC在未来HER2+乳腺癌治疗中的重要地位。

然而，仍有相当一部分患者对ADC治疗无应答。ADC单药治疗的病理完全缓解（pathological complete response，pCR）率约为 43.0%（T-DXd）至63.2%（SHR-A1811）。对于剩余未达到pCR的患者，迫切需要深入探索其耐药机制以及潜在的增敏治疗策略。

FASCINATE-N是一项Ⅱ期随机临床试验，比较了标准 PCbHP方案与 SHR-A1811的疗效和安全性。SHR-A1811是一种第三代ADC，其药物抗体比（drug-to-antibody ratio，DAR）为 5.7。SHR-A1811由一种抗HER2抗体与拓扑异构酶I抑制剂有效载荷 SHR9265偶联而成，后者是exatecan（依喜替康）的衍生物。SHR-A1811在治疗晚期HER2+乳腺癌以及HER2低表达乳腺癌方面表现出了令人鼓舞的疗效，因此成为研究ADC作用机制的理想候选药物。

此前的研究整合了多组学数据，初步描绘了FASCINATE-N试验中HER2乳腺癌对新辅助SHR-A1811治疗反应的空间决定因素。其中一个重要研究方向采用了Xenium空间转录组学平台，该平台能够在保持组织空间位置关系的同时提供基因表达信息。然而，这种方法本质上局限于RNA水平，因此可能无法充分反映最终决定药物反应和耐药的翻译后调控过程以及功能性蛋白活性。

因此，研究中，旨在弥补这一关键空白。研究重点也从最初的预测ADC敏感性转向直接解决ADC耐药这一核心问题。研究者采用空间蛋白组学技术，特别是成像质谱流式技术（imaging mass cytometry，IMC），在已有空间转录组学研究的基础上进一步拓展，通过高通量、多重蛋白检测，直接解析肿瘤微环境中的蛋白信号活动以及细胞间通信。

此外，本研究聚焦于SHR-A1811单药治疗队列，从而避免联合治疗所产生的混杂因素，使ADC耐药机制能够得到更加明确的分析。

通过这种系统、结构化且全面的研究框架，本研究能够更加直接、有针对性地探讨ADC耐药的潜在机制，并进一步寻找能够提高ADC疗效的增敏策略，从而有望使更多患者从ADC治疗中获益。

结果1、IMC测序/成像质谱流式分析概述

研究纳入FASCINATE-N试验中接受SHR-A1811单药治疗的48例HR+/HER2+乳腺癌患者，其中1例样本缺失，最终纳入47例患者：34例达到pCR，13例未达到pCR。

样本与分组：

34例pCR患者：采集治疗前活检样本，获得87个ROI。
13例非pCR患者：采集治疗前和手术后的样本，分别获得35个ROI，即non-pCR Pre和non-pCR Post。
研究的核心比较是pCR vs. non-pCR Pre，用于寻找影响ADC疗效的因素。
non-pCR Pre vs. non-pCR Post主要作为辅助分析，用于判断某些潜在耐药因素在ADC治疗后是否仍然存在或进一步富集。

IMC检测：

构建了包含35种标志物的单细胞IMC panel。

不仅检测传统的细胞类型标志物，还检测了蛋白翻译后修饰（PTM），例如：

H3K27ac：组蛋白乙酰化标志物；

O-GlcNAc：糖基化标志物。

因此能够从蛋白功能和修饰状态层面分析ADC治疗反应。

数据规模：

经过质控后，共获得157个ROI、912,360个单细胞。

无监督聚类鉴定出15种细胞表型，包括上皮细胞、基质细胞和免疫细胞。

空间与细胞组成分析：

通过pan-CK、CD45、α-SMA等经典标志物验证了细胞聚类结果：

pan-CK → 上皮/肿瘤细胞；

CD45 → 免疫细胞；

α-SMA → 成纤维细胞。

PCA分析显示，pCR、non-pCR Pre和non-pCR Post的ROI在整体细胞组成上存在差异，提示治疗前的细胞组成以及治疗后的微环境重塑都可能与ADC疗效相关。

最终比较发现，治疗前non-pCR组与pCR组具有明显不同的细胞组成，为后续寻找ADC耐药相关细胞群和空间因素奠定基础。

核心逻辑

可以把这一部分概括成一条研究路线：

47例患者 → 157个ROI → 91万单细胞 → 15种细胞表型 → 比较pCR vs non-pCR Pre → 寻找与ADC疗效相关的细胞组成、功能蛋白及空间特征 → 再利用non-pCR Post验证这些因素是否能够被ADC治疗消除。

其中最重要的是：并不是单纯描述肿瘤微环境，而是利用IMC在单细胞和空间蛋白水平寻找“为什么有些患者对SHR-A1811有效，而另一些患者产生耐药”的空间生物学原因。

结果2、单细胞图谱与SHR-A1811治疗反应

首先分析了整个队列的细胞组成，发现上皮细胞占比最高，其次为基质细胞。随后比较pCR、non-pCR Pre和non-pCR Post三组，寻找与SHR-A1811疗效相关的细胞类型。

主要发现：

与non-pCR Pre组相比，pCR组：

显著减少：成纤维细胞、中性粒细胞、树突状细胞（DC）。

显著增加：上皮细胞、内皮细胞、CD8⁺ T细胞，同时CD4⁺ T细胞和Treg也增加。

提示肿瘤间质细胞和免疫细胞组成与SHR-A1811治疗反应密切相关。

细胞类型之间的相关性发生改变：

non-pCR Pre组中，DC与成纤维细胞呈显著负相关；

pCR组中，二者则表现出正相关趋势，提示ADC敏感与耐药患者的肿瘤微环境组织关系存在差异。

CD8⁺ T细胞与上皮细胞呈显著负相关，这与CD8⁺ T细胞参与抗肿瘤免疫的生物学作用相符，也支持了分析结果的可靠性。

H3K27ac是关键发现：

在差异表达的蛋白标志物中，作者特别关注了H3K27ac（组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化）。

pCR患者的上皮细胞H3K27ac表达显著高于non-pCR Pre患者。

提示肿瘤/上皮细胞较高的H3K27ac水平可能促进SHR-A1811的治疗反应。

核心结论

这一部分建立了两个重要线索：

① ADC敏感性与肿瘤微环境组成有关：

• pCR患者具有更多的上皮细胞和T细胞，而成纤维细胞、中性粒细胞和DC相对较少。

② H3K27ac可能是ADC疗效的重要分子决定因素：

• 肿瘤细胞H3K27ac高 → SHR-A1811治疗反应更好；H3K27ac低 → 更容易出现non-pCR。

这也为后续研究进一步验证“H3K27ac如何影响ADC疗效”以及“成纤维细胞如何造成ADC耐药”提供了主要研究方向。

结果3、空间图谱与SHR-A1811治疗反应

为了寻找影响SHR-A1811疗效的空间决定因素，研究者基于单细胞空间分布进行了细胞邻域（cellular neighborhood，CN）分析，共鉴定出 10种CNs，每种CN由不同细胞类型按照特定空间组合构成。

主要发现

CN3与ADC疗效相关

• 与non-pCR Pre组相比，pCR组CN3的比例显著降低。
• 提示CN3所代表的特定细胞空间组织可能与ADC耐药相关。
• CN3与CN6之间的关系也存在治疗反应相关的差异：
• non-pCR Pre组：CN3与CN6呈显著正相关；
• pCR组：二者呈负相关趋势。
• 说明ADC敏感和耐药患者不仅细胞组成不同，其细胞之间的空间组织方式也不同。

建立ADC屏障预测（ABP）模型

为了将空间组学发现转化为临床可应用的预测工具，研究者进一步构建了ADC Barrier Prediction（ABP）模型。

模型重点整合了三种关键细胞类型之间的空间关系：

• 成纤维细胞（fibroblast） + 内皮细胞（endothelial cell） + 上皮/肿瘤细胞（epithelial cell）

• 其核心思想是：这些细胞之间的空间排列和相互作用可能形成影响ADC进入和发挥作用的“空间屏障”。

• ABP评分低 → 空间结构更有利于ADC发挥作用 → 更可能治疗敏感

• ABP评分高 → 存在更多与耐药相关的空间特征 → 更可能ADC耐药

ABP模型结果

在整个研究队列中：

• pCR < non-pCR Pre < non-pCR Post

即：

• pCR患者：ABP评分最低；
• non-pCR治疗前：ABP评分显著升高；
• non-pCR治疗后：ABP评分进一步升高。

这说明对于未达到pCR的患者，经过SHR-A1811治疗后残留肿瘤组织中的耐药相关空间特征进一步富集。

核心结论

这一部分最重要的发现是：

• ADC疗效不仅取决于肿瘤细胞本身，还受到肿瘤微环境中细胞空间排列的影响。

• 尤其是成纤维细胞、内皮细胞和肿瘤细胞之间的空间关系可能形成一种“ADC屏障”，阻碍SHR-A1811有效发挥作用。

因此，进一步提出：

• 空间屏障增强 → ABP评分升高 → ADC进入/作用受限 → 肿瘤残留 → 耐药特征进一步富集。

这为后续针对成纤维细胞/胶原基质进行干预，从而提高ADC疗效提供了理论依据。

结果4、H3K27ac⁺上皮细胞预测SHR-A1811治疗反应

研究进一步深入分析了H3K27ac⁺上皮细胞与SHR-A1811疗效之间的关系。

主要发现

H3K27ac⁺上皮细胞与治疗反应密切相关

pCR组中H3K27ac⁺上皮细胞比例显著高于non-pCR Pre组。

在RCB-low组中，H3K27ac⁺上皮细胞比例同样显著高于RCB-high组。

因此提示：H3K27ac⁺上皮细胞比例越高，SHR-A1811治疗效果可能越好。

H3K27ac⁺上皮细胞具有不同的功能蛋白特征

pCR患者的H3K27ac⁺上皮细胞中，γH2AX表达升高；

而STING和m6A表达降低。

说明H3K27ac高表达的肿瘤细胞可能存在不同的DNA损伤/应答状态，这可能与ADC诱导的细胞杀伤有关。

H3K27ac⁺上皮细胞与免疫/髓系细胞呈负相关

H3K27ac⁺上皮细胞比例与多种免疫和髓系细胞比例呈显著负相关，包括：

T细胞
B细胞
M1/M2巨噬细胞
中性粒细胞

提示H3K27ac⁺肿瘤细胞与周围免疫微环境之间存在特定的空间组织关系。

空间邻近关系是一个重要发现

研究者进一步分析了H3K27ac⁺和H3K27ac⁻上皮细胞周围25 μm范围内的细胞。

主要发现：

周围最丰富的是胶原蛋白⁺成纤维细胞，其次是CD8⁺ T细胞。
DC和CD4⁺ T细胞距离H3K27ac⁺上皮细胞更近，提示这两类免疫细胞可能参与H3K27ac⁺肿瘤细胞相关的治疗反应。
相反，胶原蛋白⁺成纤维细胞在H3K27ac⁺上皮细胞周围的比例明显降低，提示胶原阳性成纤维细胞可能与ADC耐药有关。

进一步比较pCR和non-pCR Pre发现：

pCR患者中，胶原⁺成纤维细胞和肥大细胞距离H3K27ac⁺上皮细胞更远；

而内皮细胞、Treg和单核细胞距离更近。

S100A4进一步提示胶原基质的重要性

还发现H3K27ac⁺和H3K27ac⁻上皮细胞中的S100A4表达与细胞状态之间存在相反的相关模式。

由于S100A4与细胞外基质（ECM）中的胶原水平有关，因此这一结果进一步支持：

胶原基质及其相关成纤维细胞可能是调节SHR-A1811疗效的重要因素。

核心结论

这一部分实际上建立了一个非常重要的机制模型：

H3K27ac⁺肿瘤细胞 ↑ → ADC治疗反应增强

同时：

胶原⁺成纤维细胞/胶原基质 ↑ → 形成不利的空间微环境 → ADC疗效下降/耐药

而且这种关系不仅体现在细胞比例上，还体现在细胞之间的空间距离和邻近关系上。

因此，作者开始从“肿瘤细胞自身的H3K27ac状态”和“周围胶原⁺成纤维细胞形成的空间屏障”两个方向解释SHR-A1811敏感与耐药的差异。

结果5、胶原蛋白⁺成纤维细胞预测SHR-A1811耐药

1. 胶原⁺成纤维细胞与ADC疗效负相关

• pCR组中胶原⁺成纤维细胞比例显著低于non-pCR Pre组。
• RCB-low组中胶原⁺成纤维细胞比例同样显著低于RCB-high组。
• 因此提示：

胶原⁺成纤维细胞 ↑ → SHR-A1811治疗效果下降 → 耐药增加

这与前面H3K27ac⁺上皮细胞的结果形成鲜明对比。

2. 胶原⁺成纤维细胞具有相反的功能蛋白特征

在胶原⁺成纤维细胞中：

• pCR组 γH2AX降低
• STING和m6A升高

这一表达模式与H3K27ac⁺上皮细胞中的变化正好相反，进一步提示两类细胞可能代表不同的ADC治疗反应状态。

3. 胶原⁺成纤维细胞可能阻碍CD8⁺ T细胞进入肿瘤

研究发现：

• 胶原⁺成纤维细胞与CD8⁺ T细胞比例呈显著负相关。
• 胶原⁺成纤维细胞周围25 μm范围内具有更多髓系细胞。
• 免疫细胞距离胶原⁺成纤维细胞明显更近。

这些结果提示胶原⁺成纤维细胞可能参与形成一种免疫排斥型空间微环境，限制CD8⁺ T细胞浸润。

不过作者也强调，这种负相关不能完全排除其他解释，例如致密的免疫细胞聚集可能在空间分析中掩盖成纤维细胞。

4. 胶原可能通过“物理屏障”阻止TIL浸润

作者进一步使用肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）评估这一假设。

TILs定义为CD3、CD4、CD8、Foxp3、CD56或CD20阳性的细胞，并根据IMC数据确定了14%的TIL比例作为最佳cutoff。

结果发现：

TIL-low患者 → 胶原⁺成纤维细胞比例更高

进一步支持：

胶原⁺成纤维细胞/胶原基质 ↑ → TIL浸润 ↓

但作者特别指出，14%的cutoff来自IMC数据，临床应用前仍需要在独立队列中通过标准化H&E-TIL评估进行验证。

5. 胶原不仅是“物理屏障”，还可能造成免疫抑制

作者进一步提出一个非常重要的机制：

胶原可能不仅仅是阻挡免疫细胞进入肿瘤的物理屏障，还可以主动形成免疫抑制微环境。

结果显示：

• 胶原⁺成纤维细胞周围的CD8⁺ T细胞和TILs具有更高的PD-1表达；
• 提示这些T细胞可能处于更加明显的功能耗竭状态。

因此，胶原可能通过两条途径促进ADC耐药：

① 物理屏障：
胶原⁺成纤维细胞 → ECM/胶原沉积 → 阻碍TIL、CD8⁺ T细胞浸润

② 免疫抑制：
胶原⁺成纤维细胞 → 免疫抑制性微环境 → PD-1↑ → T细胞功能耗竭

最终导致：

免疫细胞浸润和功能下降 → ADC抗肿瘤免疫效应减弱 → SHR-A1811耐药

核心结论

这一部分实际上把前面的空间分析进一步解释成了一个“胶原屏障模型”：

胶原⁺成纤维细胞 ↑
↓
胶原/ECM沉积 ↑
↓
① 阻碍CD8⁺ T细胞/TIL进入肿瘤
② 诱导PD-1⁺免疫抑制/ T细胞耗竭
↓
抗肿瘤免疫功能下降
↓
SHR-A1811疗效下降 → ADC耐药

因此，作者后续选择losartan调节胶原/基质作为联合ADC治疗的策略，就是针对这一“胶原屏障”机制进行干预。

结果6、Chidamide和losartan可增强ADC对HER2⁺乳腺癌的疗效

Chidamide和losartan可增强ADC对HER2⁺乳腺癌的疗效

基于前面的研究发现，H3K27ac⁺上皮细胞与SHR-A1811敏感性相关，而胶原⁺成纤维细胞与耐药相关，作者进一步探讨能否分别针对这两个因素进行干预，从而增强ADC疗效。

1. Chidamide可增强SHR-A1811的抗肿瘤作用

作者选择组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）chidamide，希望通过提高H3K27ac水平来增强ADC疗效。

在SKBR3和BT474 HER2⁺乳腺癌细胞中：

• SHR-A1811单药具有一定抗肿瘤作用；
• chidamide单药也具有一定作用；
• SHR-A1811 + chidamide联合治疗表现出显著的协同作用；
• 克隆形成实验进一步证明，联合治疗比SHR-A1811单药更加明显地抑制肿瘤细胞增殖。

这一结果不仅在细胞系中得到验证，还在：

• 患者来源类器官（PDO）
• 患者来源异种移植模型（PDX）
• 细胞系来源异种移植模型

中均观察到了明显的协同抗肿瘤作用。

2. Losartan可以通过降低胶原增强ADC疗效

由于前面的研究发现胶原⁺成纤维细胞可能通过胶原基质形成ADC耐药微环境，作者进一步使用具有胶原调节/减少作用的losartan进行干预。

在小鼠模型中发现：

SHR-A1811 + chidamide
以及
SHR-A1811 + losartan

均比SHR-A1811单药表现出更强的肿瘤生长抑制作用。

进一步通过免疫荧光发现：

SHR-A1811 + losartan → 胶原IV↓ + CD8⁺ T细胞浸润↑

说明losartan降低胶原后，可能解除胶原形成的物理屏障，使更多CD8⁺ T细胞进入肿瘤，从而增强ADC治疗效果。

因此作者提出：

losartan可能通过减少胶原基质、解除免疫细胞浸润障碍，从而提高ADC疗效。

3. 在接受T-DXd治疗的患者中进一步验证

为了验证上述发现是否具有临床普适性，作者进一步分析了45例接受T-DXd治疗的晚期HER2⁺乳腺癌患者。

根据治疗反应分为：

• Responder（R）：完全缓解（CR）+部分缓解（PR），23例
• Non-responder（NR）：疾病进展（PD）+疾病稳定（SD），22例

结果发现：

H3K27ac

H3K27ac/PanCK强度比值：

R组 > NR组

并且：

H3K27ac/PanCK高 → 患者生存更好

胶原IV

Collagen IV/DAPI强度比值：

R组 < NR组

并且：

Collagen IV/DAPI高 → 患者生存更差

因此，在另一种ADC——T-DXd治疗患者中，也验证了前面的结果：

H3K27ac高 → ADC敏感 → 预后较好

胶原IV高 → ADC耐药 → 预后较差

说明这两个空间标志物可能不仅适用于SHR-A1811，也可能具有更广泛的ADC预测价值。

H3K27ac通过促进ERBB2转录上调HER2表达

作者进一步深入研究：为什么H3K27ac能够增强ADC疗效？

SHR-A1811携带的是拓扑异构酶I抑制剂SHR9265，因此作者首先考虑这种增敏作用是否依赖于payload。

他们使用另一种HER2 ADC——disitamab vedotin（维迪西妥单抗）进行验证，该ADC携带的是不同类型的payload——MMAE（单甲基澳瑞他汀E）。

结果发现：

chidamide同样可以增强disitamab vedotin的疗效。

因此说明：

H3K27ac/chidamide的ADC增敏作用并不依赖于特定payload。

4. 机制：H3K27ac → ERBB2转录↑ → HER2表达↑ → ADC靶点增加

作者进一步进行了H3K27ac ChIP-seq分析。

结果发现：

H3K27ac在ERBB2启动子区域显著富集。

ERBB2就是编码HER2的基因。

随后在SKBR3和BT474细胞中使用chidamide处理，发现：

• ERBB2 mRNA↑
• HER2总蛋白↑
• 细胞膜表面HER2表达↑

而且这一现象不仅出现在HER2⁺细胞中，在部分HER2⁻乳腺癌细胞中也能够观察到。

因此作者提出了一个非常关键的机制：

chidamide → HDAC抑制 → H3K27ac↑
↓
H3K27ac富集于ERBB2启动子
↓
ERBB2转录↑
↓
HER2表达↑
↓
肿瘤细胞表面HER2靶点增加
↓
更多ADC可以结合并进入肿瘤细胞
↓
ADC治疗敏感性↑

核心结论

这一部分把前面的空间组学发现进一步转化成了可干预的治疗策略：

所以这篇文章最终形成了一个比较完整的逻辑链：

空间组学发现 → H3K27ac与胶原是ADC疗效的两个关键空间决定因素 → 机制验证 → chidamide/losartan干预 → ADC增敏 → 患者队列验证。

最后，来看看方法

IMC数据分析

生活很好，有你更好。