单细胞测序基础知识
一、单细胞测序
学习scRNA-seq先了解一下Bulk RNA-seq
Bulk RNA-seq：测量一个大的细胞群体中每一个基因的平均表达水平，对比较转录组学（例如比较 不同物种的相同组织） 是有帮助的，但对于研究异质性系统（例如，复杂的组织如脑）还是不够的，对于基因表达的本质研究不够深入。
scRNA-seq：
2009年由Tang首创，随着测序技术的发展及测序成本的的下降，2014年才逐渐流行开来。它测定的是细胞种群中每个基因的表达量分布，对于研究特定细胞转录组的变化是重要的。
通量：测定的细胞量也由最初的10个左右，达到了现在的百万并且还在不断递增，向着高通量的方向发展。
测序流程：现在主流的主要10X Genomics Chromium（较多细胞），SAMRT-seq2（较多基因）和Fluidigm C1等。当然还有其他的如：CELL-seq、Drop-seq、mas-seq和Wafergen ICELL8等。
二、单细胞测序流程
三、方法主要分为两大部分：定量与分离。
- 定量包括两种类型：全长以及基于标签(tag)。前者对每个转录本都试图获得一致的read覆盖度，后者只捕获5‘或者3’端的RNA。定量方法的选择也影响了后续分析的方法选择。理论上，全长的方法应该得到转录本的平均覆盖度，但是实际上，覆盖度经常是有偏差的。基于标签的方法能够利用特异性分子标记(Unique Molecular Identifiers, UMIs)提高定量准确度，但是呢，这种限制了转录组一端的方法有降低了转录本的可拼接性，让以后的isoform识别变得困难。
单细胞分离（Isolation of Single Cells）
单细胞分离方法：包括有限稀释法（Limiting dilution technique）、显微操作法（micromanipulation）、流式细胞分选(FACS)、激光捕获显微分离(LCM)、微孔（microwell）、微流控（microfluidics）和微滴（droplet）。
有限稀释技术（Limiting dilution technique）是利用移液管稀释分离细胞，这种方法的主要缺点是效率低下，成功率20%左右。
显微操作法（micromanipulation）是一种经典的方法，用于从少量细胞样本中提取细胞，如早期胚胎或未培养的微生物，缺点是耗时和低通量的。
流式细胞分选(FACS)广泛用于分离单个细胞，在悬浮状态下需要较大的起始体积(>10,000个细胞)。
激光捕获显微分离(LCM)是利用计算机辅助的激光系统将单个细胞从固体组织中分离出来。
微孔microwell 优势是可以与荧光触发细胞分离技术(FACS)结合，实现基于表面标记的细胞选择。对于想要分离特定细胞群的研究很有效；另外一个优势就是，可以对细胞进行拍照，帮助确定孔中是否存在损伤的或者重复的细胞。缺点是通量低，对每个细胞进行操作需要很大的工作量。
微流控（microfluidics）相对微孔，它的通量更高。缺点是只有10%的细胞能被捕获到，加入处理的细胞类型比较稀少，那么能被芯片捕获的就更少了，通量不高，成本高。
微液控制技术 例如Fluidigm's C1
微滴技术 是将单个细胞包裹在µl级别的液滴中，液滴被搭载到建库所用的酶上，每个微滴包含一个独特的条码(barcode)，由那个被包装好的细胞产生的所有reads都被贴上了该条码，也是为了之后对于不同细胞reads的分辨。一般微滴技术的通量最大，查资料得知一秒能包装7万个以上的液滴，并且建库费用合适--0.05美元/细胞。但是高额测序费用又成了他的短板，鉴定出的一般只有一千多个差异转录本，覆盖度还是比较低的
这些单细胞分离方案具有各自的优点，可以根据研究目的来选择合适的分离方法。
四、分析流程
黄色部分对于高通量数据的处理都是差不多的流程；
橙色的部分需要整合多个转录组分析流程以及显著性分析，来解决单细胞测序的技术误差；
蓝色是下游表达量、通路、互作网络等分析，需要使用针对单细胞研发的方法。
五、应用
单细胞技术揭示细胞的异质性、细胞分化、发育过程中不同的生理状态下的变化、疾病发生病变等生物学过程。
单细胞转录组测序主要应用方向
1.大规模细胞图谱构建
特定组织裂解后通过单细胞测序获得单细胞转录组图谱，并基于每个细胞基因表达谱数据进行细胞类型聚类，分析研究复杂器官中不同细胞亚型的功能，了解细胞间的差异以及各种细胞群体间的协作关系。
2.细胞亚群细化&稀有细胞类型鉴定
在单细胞类型聚类基础上，依照已知细胞类型标志基因表达情况和新基因表达情况，进一步细分细胞类型并发现新的细胞亚群，分析各个小亚群细胞差异，小亚群细胞和稀有细胞类型在生物学过程参与的功能。
3.肿瘤方向研究
- 肿瘤细胞异质性
- 肿瘤微环境
- 肿瘤耐药性
- 肿瘤干细胞分化
4.干细胞发育及分化研究
通过单细胞测序全面解析干细胞异质性，鉴定干细胞分化不同阶段的不同类型分化过程细胞，鉴定不同亚型干细胞Marker基因，绘制干细胞发育和分化轨迹，解析干细胞发育和分化的分子机理。
5.免疫方向研究
- 构建免疫图谱
构建血液或肿瘤微环境、特定组织器官或疾病状态下免疫细胞构成，分析免疫细胞异质性，解析机体复杂的免疫机制；发现新的免疫细胞Marker基因，鉴定稀有免疫细胞类型。
- 免疫细胞分化
鉴定不同疾病状态、诱导条件下免疫细胞基因表达变化，鉴定不同分化方向免疫细胞Marker基因，绘制免疫细胞细胞发育和分化轨迹
6.神经科学研究
研究神经元细胞分群情况以及不同神经元细胞类型的异质性，了解神经干细胞-神经元细胞分化过程的分子调控机制。
7.发育生物学
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脑发育研究
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可以获得复杂的脑细胞基因表达图谱，构建脑细胞群体，解析脑细胞的异质性以及不同亚群细胞的特定功能。
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胚胎细胞发育研究
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8.生物标志物/疾病分型
发现并鉴定异常增殖的细胞类型，结合传统病理学特征，辅助疾病分型
参考
Analysis of single cell RNA-seq data https://scrnaseq-course.cog.sanger.ac.uk/website/index.html
单细胞测序的知识 - 简书 https://www.jianshu.com/p/9fc521bf82ba
单细胞转录组测序的应用方向_类型 http://www.sohu.com/a/295025334_769248
