分步PCR的优点：对酶切位点没有严格的限制
缺点：非常容易产生突变，尤其是coincide的部位
以一个长达6800bp的目的基因AFAP1-AS1为例，将其分成两个中等大小的片段来进行构建。（一开始是直接做全长，结果PCR结果啥都没有哈哈）
首先一下是基因的全长，根据预实验结果，在红线那个位置分隔开，将其分成1-3010的a段及3011-6810的b段两个片段。一般来说4kb以下还是很好构建的。
在设计引物时，需要将A片段的末尾和B片段的起始处设计出15bp大小的重合序列（coincide），第一次PCR得到A、B两个片段，如图有15bp的重合序列。
下图是设计引物的示意图，引物F+R1可得到A段，引物F1和R可得到B段（已含有coincide）
第一次PCR：F+R1+cDNA→A，F1+R+cDNA→B；
因为F和R端是全长的两端。因此需要设计出所需要的酶切位点 ，这个可以根据自己的载体来确定。引物设计方法见前文LncRNA 过表达慢病毒载体引物设计 - 简书
因此设计出了以下引物，加粗部分是靶向序列，未加粗部分是引入的酶切位点
F：CCGCTCGAGCGGGCTGCTGCCACGTAAGAA
R：GCTCTAGAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTTTGACTTTGTGTT
F1：AAAATTAGGTTTATTCAAGCA
R1：AATAAACCTAATTTTTTTTTG
如图是coincide部位的设计图：
第二次PCR：F+R+A+B→full-length
然后再对PCR得到的目的基因和载体分别做酶切即可。
