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2023年6月Int J Mol Sci在线发表PEBP基因家族文章”Genome-Wide Identification of PEBP Gene Family in Solanum lycopersicum"。

摘要

PEBP基因家族对植物的生长发育、营养和生殖生长的转变、光反应、florigen的产生以及对多种非生物胁迫的反应起着重要作用。PEBP基因家族在许多物种中都有发现，但番茄PEBP基因家族尚未进行全面的生物信息学研究，并且该基因家族的成员目前尚不清楚。本研究利用生物信息学方法在番茄中鉴定了12个SLPEBP基因家族的成员并将其定位于染色体上。还研究了SLPEBP基因家族成员编码的蛋白质的物理化学特性，以及它们的种内同源性、基因结构、保守motif和顺式作用元件。同时，建立了一个系统发育树，并研究了番茄、马铃薯、辣椒和拟南芥之间PEBP基因家族的共线关系。利用转录组数据分析了番茄不同组织和器官中的12个基因的表达情况。还假设SLPEBP3、SLPEBP5、SLPEBP6、SLPEBP8、SLPEBP9和SLPEBP10可能与番茄的开花有关，SLPEBP2、SLPEBP3、SLPEBP7和SLPEBP11可能与子房发育有关，基于SLPEBP基因家族成员在花芽形成到果实定植期五个不同阶段的组织特异性表达分析。本文旨在为进一步研究番茄PEBP基因家族成员提供建议和研究方向。

1.引言

磷脂乙醇胺结合蛋白(PEBP)基因家族是一类高度保守的蛋白质，在各种生物组织中均有发现。这些蛋白最初是从牛脑中分离出来的，并因其对磷脂类物质具有很强的亲和力而被命名为磷脂乙醇胺结合蛋白。许多已知PEBP-like家族成员的结构显示，PEBP具有一个包含相当大的中央β-折叠的保守结构域。这个大的β-折叠由一个小的β-折叠和一个α-螺旋组成。PEBP基因家族控制着许多生物过程。一些研究发现PEBP基因可以参与调节开花和与生长相关的信号通路，并在植物类型分化中起重要作用。植物中的PEBP基因家族可以分为三个不同的亚群：类似于FLOWERING LOCUS T基因(FL)被认为参与了编码florigen；TERMINAL FLOWER1 (TFL1)-like基因与抑制开花相关；类似于MOTHER OF FT AND TFL1的基因(MFT)与调节种子萌发有关。拟南芥的FT、TSF和番茄的SFT基因就是FL-like基因。已经证明SFT产生信号引导开花，在植物分生组织生长中发挥调节作用。拟南芥的TFL1、ATC和BFT以及番茄的SP基因都是TFL1-like基因，SP可以拮抗SFT的作用。SFT/SP平衡控制着开花的起始时间，与florigen一起构成了开花调节机制，并调节分枝分生组织的生长和停止。拟南芥的MFT基因是一个MFT-like基因，参与种子萌发。根据以前的研究，植物PEBP基因家族的复制事件与植物进化同时发生。在苔藓植物中只发现了MFT-like基因，而MFT-like基因可能可以追溯到陆地植物的起源。由于缺乏裸子植物的基因组序列，FT-like和TFL-like基因的起源存在争议，但它们的基因复制事件与种子植物的进化相吻合。进一步的研究显示，FT-like和TFL-like基因在裸子植物中已经发生分化，FT-like基因最近经历了选择。在许多植物中已经鉴定出PEBP家族成员，如烟草、玉米、水稻和大豆。拟南芥已经发现了六个成员——FT、TSF、TFL1、BFT、ATC和MFT。在花椰菜中鉴定出了10个成员，其中一些成员影响了花菜的结球和开花，研究表明TFL1基因的高表达和促进开花基因(FT、TSF)的低表达水平可能是影响花菜结球的因素之一。在棉花中鉴定PEBP基因家族，通过鉴定四个棉花品种，两个四倍体和两个二倍体，前者鉴定出了21个和20个成员，后者分别鉴定出了10个成员。

番茄是最受欢迎的蔬菜作物之一。番茄果实具有独特的风味，可以生食或烹饪，具有很大的经济和营养价值。根据茎顶部的花序发育，番茄有两种生长类型，确定性生长和不定性生长，是一种典型的分枝作物。确定性生长类型通常以矮小的植株、早熟果实、集中成熟和相对较低的产量为特征，而不定性生长类型则相反，植株高大，生长期较长。由于这两种类型的番茄在许多方面有明显的差异，研究番茄的生长习性及其调控基因非常重要。已经发现了番茄PEBP基因家族的8个成员：SP2G、SP3C、SP3D（SFT）、SP3I、SP5G、SP6A、SP和SP9D。这八个基因在番茄的生长过程中具有类似的功能，并在调节番茄植株类型方面起到了直接和间接作用。可以抑制番茄开花的番茄SP基因是CEN基因和拟南芥TFL1基因的同源基因。SP基因可以调节番茄的确定性或不定性生长。基因突变后，番茄由不定性生长转变为确定性生长，植株型变得紧凑密集，成熟度一致。SP基因突变体有利于番茄的机械采摘。SP3D与拟南芥的FT基因同源，其缺失可以延长番茄的开花期。SP5G调节番茄的光周期敏感性。尽管已经鉴定和研究了番茄PEBP基因家族的多个成员，但它们尚未进行系统的生物信息学分析。本研究利用生物信息学技术对番茄SLPEBP基因家族的12个成员进行了研究，进行了染色体定位并构建了系统发育树。此外，分析了它们的共线性、基因结构和保守motif、蛋白质三维结构和顺式作用元件的类型。使用栽培番茄品种Heinz的转录组信息，检查了SLPEBP基因家族12个成员在不同器官和组织中的表达情况。分析了番茄花在五个不同阶段的组织表达特异性。本研究的发现将有助于进一步阐明PEBP基因在番茄开花和植物发育中的功能，并为改良现有番茄品种和创造新品种提供建议。

2.结果

2.1.番茄中PEBP基因家族成员的鉴定以及编码蛋白质的物理化学特性分析

通过使用HMMER 3.0软件进行分析，结合HMMER和SMART在线软件进行筛选，对12个PEBP家族成员进行了分析，命名为SLPEBP1-12。SLPEBP基因家族的基本信息以及其编码蛋白质的物理化学特性在表格1中显示。此外，表格中还列出了这些命名的基因。

2.2. 番茄中PEBP基因家族成员的染色体定位和共线性分析

图1展示了SLPEBP基因家族在染色体上的定位以及物种内的共线性关系。SLPEBP基因家族的成员仅部分分布在番茄的染色体上，并且分散分布，共有12个基因分布在七个番茄染色体上，大多数基因相对靠近染色体的端粒区域。只有SLPEBP基因家族的12个成员中的 SLPEBP5位于远离端粒区域的位置。在这12个SLPEBP基因家族成员中，只有SLPEBP5位于低基因密度区域。基因间共线性分析显示了基因之间的复制关系，物种内的这些关系显示在图1中。SLPEBP基因家族成员在物种内仅有一个共线关系，即SLPEBP1与SLPEBP9之间存在共线关系。

图1SLPEBP基因家族成员在染色体上的位置和物种内的共线性。左侧的刻度用于估算染色体的长度。SLPEBP基因家族成员按顺序编号为1到12，并以红色标记。黄色数字代表染色体编号。染色体上从蓝色到红色的渐变表示基因密度。红线表示SLPEBP基因家族成员的物种内共线性。为了确定12个SLPEBP家族基因与其他物种的共线关系，使用拟南芥、马铃薯和辣椒的PEBP家族成员对番茄进行了共线性分析。分析结果显示在图2中展示。番茄与马铃薯有11个共线关系，与辣椒有10个共线关系，与拟南芥有4个共线关系。SLPEBP2和SLPEBP5与其他物种的基因没有共线关系。在这三个物种中，SLPEBP与STPEBP最为密切相关。将SLPEBP家族与其他物种进行比较分析可以提供研究参考，用于分析物种的遗传关系和基因功能。番茄SLPEBP基因与马铃薯、辣椒和拟南芥的共线关系可以在附表S1中找到。

图2SLPEBP基因家族成员与拟南芥、马铃薯和辣椒之间的物种间共线关系。 番茄、拟南芥、马铃薯和辣椒的染色体以不同的颜色标记。染色体上方标记了染色体编号。不同物种的PEBP基因家族成员与SLPEBP基因家族成员之间的共线关系通过不同颜色的连线连接。绿色线表示番茄与马铃薯之间的关系；蓝色线表示番茄与辣椒之间的关系；红色线表示番茄与拟南芥之间的关系。红色三角形表示SLPEBP基因的位置。

2.3. 系统发生关系分析

为了研究SLPEBP基因与其他同源基因之间的系统发生关系，使用10个已鉴定的ATPEBP蛋白、10个STPEBP蛋白、11个CAPEBP蛋白和12个SLPEBP蛋白的氨基酸序列构建了系统发生树（图3）。系统发生树被分为三个亚科：TFL1、FT和MFT。其中，16个基因属于TFL1亚家族（包括五个SLPEBP基因：SLPEBP1、SLPEBP2、SLPEBP4、SLPEBP9、SLPEBP11）。15个基因属于FT亚家族（包括四个SLPEBP基因：SLPEBP5、SLPEBP7、SLPEBP8、SLPEBP12），12个基因属于MFT亚家族（包括三个SLPEBP基因：SLPEBP3、SLPEBP6、SLPEBP10）。

图3系统发生树：包括12个SLPEBP基因、7个ATPEBP基因、10个STPEBP基因和11个CAPEBP基因。不同物种用不同颜色的实心点标记。红色代表番茄，绿色代表拟南芥，蓝色代表马铃薯，黄色代表辣椒。这三种颜色分别代表PEBP基因家族的三个不同亚家族。

2.4. 番茄PEBP家族成员保守基序和基因结构分析

使用MEGA-X构建了一个只包含SLPEBP家族基因的系统发生树，将亚家族分为三个群体，与先前的进化树结果一致。基于这棵树，我们对SLPEBP基因家族成员进行了保守基序和基因结构的分析（图4）。

图4SLPEBP基因家族成员的基因结构和保守基序。

（A）SLPEBP基因家族成员的系统发生树。（B）SLPEBP保守基序的分布顺序。不同的基序用不同颜色的方框标记。（C）SLPEBP基因家族成员的UTR和CDS分布。绿色表示UTR，黄色表示CDS。底部的刻度用于比较不同基因和蛋白质的长度。

在基因结构分析中，六个SLPEBP家族基因含有四个外显子和两个内含子，占总体SLPEBP基因家族成员的50%。九个基因含有四个外显子，占家族成员的75%。七个基因含有两个内含子，占家族成员的58.3%。九个基因含有内含子，占家族成员的75%。大多数SLPEBP基因家族成员含有四个外显子，其成员中大部分含有一个或两个内含子。在保守基序分析中，发现了10个保守基序，并命名为motif 1-10。除了SLPEBP3、SLPEBP6、SLPEBP8、SLPEBP10和SLPEBP12之外的所有基因均含有这10个保守基序，并且这10个基序按相同顺序排列。只有motif 3和motif 4被所有12个SLPEBP基因家族成员共享。最完整的保守基序出现在TFL1亚家族中，其次是FT亚家族。

2.5. SLPEBP蛋白的三维结构预测

基因所编码蛋白的结构与基因的功能相关。同源建模是一种利用已经通过实验证实的蛋白质的氨基酸序列作为模板，构建目标蛋白质的三维结构的方法。利用同源建模方法，我们预测了12个SLPEBP蛋白的三维结构。除了SLPEBP10之外，通过在线软件的检测和评估，我们得到的11个基因的三维结构都被评估为准确。如图5所示，这11个蛋白质都含有一个大的β折叠结构，其中10个蛋白质（SLPEBP8除外）还含有两个α螺旋结构。

图5SLPEBP家族成员蛋白的三维结构模型。黄色代表β折叠，粉色代表α螺旋，青色代表β转角，蓝色代表不规则卷曲。半透明部分显示蛋白质的外表面。

2.6. SLPEBP家族成员顺式作用元件的预测

顺式作用元件对基因转录起着重要作用，在本研究中，使用每个基因上游2000个碱基对的序列来预测SLPEBP家族12个基因的顺式作用元件（图6）。共检测到36个顺式作用元件，并分为六类：发育相关元件（18个），环境胁迫相关元件（27个），激素响应元件（84个），光响应元件（141个），启动子相关元件（1166个）和结合位点相关元件（13个），总计预测出1448个顺式作用元件。除了SLPEBP2基因外，所有SLPEBP基因都含有G-box。除了SLPEBP4外，所有家族成员都含有Box 4。在SLPEBP家族成员启动子区域的顺式作用元件中，光响应元件的数量最多（141个）。发育相关元件的数量最少（18个）；SLPEBP7不含任何发育相关元件。关于SLPEBP基因启动子区域顺式作用元件的详细信息可见表S2。

图6SLPEBP基因家族启动子区域（-2000 bp）顺式作用元件的预测与分析。(A) SLPEBP启动子区域（-2000 bp）顺式作用元件的分布情况。不同的颜色和形状代表不同类型的顺式作用元件。底部的标尺表示序列的方向和长度。(B) 顺式作用元件的分类与统计。共有38种顺式作用元件，被分为六个类别。格子中的数字表示元件的数量，从蓝色到红色代表元件数量由少到多。

2.7. SLPEBP基因在番茄不同组织器官中的表达

分析结果如图7所示。有四个基因在芽、花和根中显著表达，而有两个基因在叶片中显著表达。一些基因（SLPEBP3，SLPEBP12）在多个组织中表达，而一些基因（SLPEBP8，SLPEBP10）在任何被检测的组织中都没有表达。番茄不同组织中SLPEBP基因转录组的平均FPKM值详见表S3。

图7SLPEBP基因在不同组织中的表达。在不同番茄器官中，对每个基因的每千碱基转录物的绝对片段数（FPKM）值进行行归一化后，绘制了热图。左侧的树状图显示了基因间聚类分析的结果。

2.8. SLPEBP基因家族的qRT-PCR基因表达分析

我们在五个不同的开花期间确定了SLPEBP1到SLPEBP12所有12个基因的基因表达情况，结果如图8所示。其中，SLPEBP1和SLPEBP12的表达非常低，因此在图中未显示。在这12个基因中，SLPEBP3、SLPEBP5、SLPEBP6、SLPEBP8、SLPEBP9和SLPEBP10在开花期间表达水平较高，可能参与花朵的开放过程。其他基因可能与子房的形成有关，并可能在番茄产量中发挥调节作用。

图8在番茄材料的五个不同开花阶段，对10个SLPEBP基因家族成员的基因表达进行了分析。不同的灰度代表不同的开花时间。不同的字母表示显著差异，相同的字母表示没有显著差异。柱状图显示了标准偏差。

3.讨论

植物的生长类型（决定型、不决定型和半决定型）、开花时间、花朵数量以及花器官的发育与番茄的产量密切相关。目前，机械化和自动化的收获和加工正逐渐取代传统的人工劳动，进一步提高了生产效率，节约了时间和成本。为了适应机械化收获，有必要研究番茄的植株类型。PEBP基因家族的成员在植物的生长类型、开花期、花器官的发育、种子萌发、根形态发生甚至非生物逆境抗性等方面都具有明显的功能。已经有报道称该家族中的基因突变会导致番茄的开花、花器官形态、植物生长类型、根形态等发生变化。然而，还没有一篇文章对番茄中的PEBP基因家族进行全面的研究和总结，以检验其家族成员的共同特点。我们通过番茄基因组数据库预测出了包含PEBP保守结构域的12个基因，这与Cao等人和Moreira等人的结果一致。通过数据分析，研究发现该家族中的基因参与了转录调控；此外，胁迫和信号传导具有很强的同源性和大的基因家族，而涉及基本功能的基因同源性较弱且基因家族较小。SLPEBP基因家族只有12个成员。可以推断SLPEBP基因家族的基因功能相对基础。采用相同的方法，我们预测了拟南芥、马铃薯和辣椒中的PEBP基因家族成员，并进行了相同的分析。发现了拟南芥PEBP基因家族的7个成员。由于马铃薯参考基因组不同，10个马铃薯PEBP基因家族成员的结果与Zhang等人检测到的15个PEBP基因家族成员的结果不同[40]。由于参考基因组和方法不同，11个辣椒PEBP基因家族成员的结果与Niu等人检测到的9个PEBP基因家族成员的结果略有不同。我们发现SLPEBP基因家族的12个基因在七条番茄染色体上分布不均（图1），除了SLPEBP5以外，所有其他基因都分布在染色体的远端。基因复制事件在植物中经常发生。通过这种方式，植物可以以更高的效率进行进化。基因家族成员都来自同一个祖先，并通过基因复制事件、突变、驯化和选择形成了一组编码类似蛋白质产物的基因，这些蛋白质具有相似的序列和结构。基因复制事件可以分为全基因组复制和单基因复制。全基因组复制产生的重复基因往往在一段时间后丧失或沉默，植物迅速回归二倍体状态。单基因复制可以以多种方式发生，如串联复制（TD）、邻近复制（PD）、扩散复制（TRD）和分离复制（DSD）。番茄基因组中超过60%的基因都是由基因复制事件演化而来[45]。种内一致性分析显示，只有SLPEBP1和SLPEBP9基因存在一致性，表明SLPEBP基因家族成员的拷贝较少，或者它们在演化过程中被丢弃的更多。同时，为了进一步分析植物中SLPEBP基因家族成员的同源关系，我们对番茄、马铃薯、辣椒和拟南芥进行了种间一致性分析。观察到的一致性从高到低依次为马铃薯（11个）、辣椒（10个）和拟南芥（4个）。这个结果与遗传距离一致。SLPEBP2和SLPEBP5与其他三个物种没有一致性关系，可能是番茄特有的。SLPEBP4、SLPEBP6和SLPEBP9与马铃薯、辣椒和拟南芥都存在一致性关系。这三个基因可能在PEBP基因家族的演化中发挥重要作用，或具有不可替代的功能。使用MEGA-X构建了番茄、拟南芥、辣椒和马铃薯PEBP基因家族成员的系统进化树。这个进化树将这些成员分为TFL1、FT和MFT三个亚组（图3）。在TFL1分支中，拟南芥TFL1（AT5G03840）与FT具有对抗性。已经证明TFL1可以在顶端分生组织（SAM）中移动，调控花期转变，并调控数百个基因的表达。拟南芥ATC（AT2G27550）能够抑制花期转变，在短日条件下其表达被诱导[50]。番茄SP3C（SLPEBP4）在敲除后发现能够促进种子萌发，过表达可以提高幼苗对水分胁迫的耐受性，并与根形态发生相关。Puneli等人发现SP（SLPEBP9）与CEN和TFL1同源。SP基因中的单个氨基酸突变导致番茄从不决定性生长变为决定性生长。Solanum pennellii SP9D（SLPEBP11）胁迫系统可能与半决定性生长相关。在FT分支中，拟南芥FT（AT1G65480）是一种参与花期转变过程的花发生整合基因。拟南芥BFT（AT5G62040）被发现在高盐和干旱条件下参与轴花序发育和调控花期转变。拟南芥TSF（AT4G20370）与FT相互作用，但目前对其作用方向尚不清楚。番茄SP5G（SLPEBP7）与番茄的光周期敏感性有关，是一种花期复制子，其变异使栽培番茄能够在更广泛的地区种植而不受光周期影响。Zhang等人发现野生番茄从长日照植物到栽培番茄的光敏变化是由于SP5G 3′非翻译区增强子失去52个碱基对的结果。番茄SP3D/SFT（SLPEBP5）是控制花器官形成的重要基因，负责编码花素原，调控番茄从营养生长转变为生殖生长。当SFT功能丧失等位基因是杂合的时候，可以使产量增加60%以上并表现出强烈的杂种优势。通过调整花素原和反花素原之间的平衡，可以微调和优化番茄的产量，以实现最大产量。马铃薯SP6A（PGSC0003DMT400060057）控制块茎维管束传递信号，并与IT1形成复合体，调节马铃薯块茎的形成。其PEBP结构域的缺失导致马铃薯无法产生块茎。在MFT分支中，拟南芥MFT（AT1G18100）基因被发现通过ABA和GA信号通路促进开花，并调控拟南芥种子的萌发。通过一致性和系统进化树分析，发现PEBP基因家族的功能与花素原的合成、花期转变的调控、光敏感性、植物生长发育以及一些非生物胁迫响应有关。此外，PEBP基因家族在不同物种中的功能差异很大。显然，拟南芥是短日植物，而番茄是长日植物。这两种植物中PEBP基因家族的响应结果相似，但调控方式相反。在对SLPEBP基因的保守模体分析中，这10个保守模体中只有第6和第8个模体出现在所有12个SLPEBP基因中。除SLPEBP3、SLPEBP6、SLPEBP8、SLPEBP10和SLPEBP12外，所有的基因都包含了这10个保守模体，并且这10个模体的排列顺序相同。目前还没有关于这五个基因功能的详细报道。在包含全部10个保守模体的基因中，SLPEBP1和SLPEP2没有被发现有特定的功能。SLPEBP3、SLPEBP6和SLPEBP10属于MFT亚家族。认为FT和TFL1亚家族起源于这个亚家族的基因，可能是这三个基因的保守模体不完整的原因。SLPEBP基因家族保守模体的预测为基因分类和功能预测提供了理论依据。SLPEBP基因家族的基因结构基本由四个外显子组成，75%的家族成员含有四个外显子，而基因家族内的内含子丧失，最多只有两个内含子。SLPEBP8有五个外显子，SLPEBP10只有两个外显子。SLPEBP12有八个外显子，基因结构与保守模体分析吻合，因此很可能是两个基因拼接而成。蛋白质的三维结构决定了它们与其他分子的相互作用，并确定了它们在细胞中的作用。丰富的蛋白质三维结构使它们能够在细胞中执行大量的功能，并且可以从它们的氨基酸序列推断出蛋白质的三维结构。从蛋白质的三维结构预测中，我们可以看到SLPEBP基因家族由一个相似的结构域组成，其中SLPEBP1、SLPEBP2和SLPEBP4的三维结构预测结果非常相似，它们属于同一亚家族。预测结果符合基因家族蛋白质的特征，并且都具有相似的保守结构域。在蛋白质转录过程中，基因启动子及其顺式作用元件起着重要的调节作用。编码蛋白质的基因的核心启动子通常包含一个“TATA-box”。顺式作用元件和核心启动子可以成为转录结合位点，调控蛋白质的特异结合位点。通过顺式作用元件的分析，发现SLPEBP基因家族的所有12个成员都含有“TATA-box”。顺式作用元件的分析结果可以分为六类：18个与发育相关的元件（8种）、27个与环境胁迫相关的元件（5种）、84个激素响应相关元件（9种）、141个光响应元件（20种）、1166个启动子相关元件（4种）和13个结合位点相关元件（4种）。光响应元件在SLPEBP基因家族中最丰富。除了与基本功能相关的顺式作用元件（启动子相关元件和结合位点相关元件）外，光响应元件的数量也是最多的，这证明SLPEBP基因家族成员的功能与光响应有关，这与前面讨论的结果一致。此外，SLPEBP基因家族成员还参与植物生长发育、非生物胁迫响应、激素调节等功能。这一分析结果也可以在之前的讨论中得到证实。在鉴定了启动子区域的顺式作用元件后，我们发现顺式作用元件在启动子区域中不规则地分布（图6B）。分布在不同位置的顺式作用元件有利于在不同环境刺激下调节蛋白质的功能。SLPEBP基因家族的一些成员，如SP9D、SP、SP5G和SP3D，在西红柿的许多组织和器官中表达。然而，还没有研究分析所有12个SLPEBP基因在西红柿不同组织和器官中的表达情况。只有对SP、SFT和SP5G等12个SLPEBP基因家族成员的表达和调控机制进行了更清楚的研究。通过RNA-seq数据的分析，我们发现SLPEBP基因家族的一些成员具有组织特异性表达（图7）。其中，SLPEBP1、SLPEBP2、SLPEBP9和SLPEBP11在西红柿的根部中特异表达，这可能与根的发育或生长调控有关，有趣的是，它们都属于TFL1亚家族。SLPEBP4、SLPEBP6和SLPEBP12在芽和花中特异表达，可能与花的分化和发育有关。SLPEBP5在花中特异表达，SLPEBP3在芽中特异表达。SLPEBP8和SLPEBP10在所检测的任何组织和器官中均未发现表达，它们的表达可能与西红柿的所检测的器官无关或者在Heinz 1706中不表达。我们选择了从开花到结实的五个不同阶段的西红柿进行组织特异性表达分析，希望能够确定SLPEBP基因家族在开花过程中起作用的阶段。SLPEBP3、SLPEBP5、SLPEBP6、SLPEBP8、SLPEBP9和SLPEBP10在芽或未完全开放的花中具有很高的表达量，我们推测它们可能参与了西红柿的开花调控。其他基因在开花或果实形成过程中的表达变化较大，因此推测它们可能参与了子房发育的调控。

4.材料和方法

4.1. 番茄生长和处理实验材料采用栽培番茄品种Ailsa Craig。植物材料于2022年4月种植在东北农业大学的一个温室中，于10月（126.916 E，45.773 N）进行采样。采集了番茄花蕾、未完全开放的花朵、完全开放的花朵以及果实成熟3天和5天的器官，以检测基因表达。

4.2. 总RNA提取和cDNA合成使用TaKaRa RNA提取试剂盒（Takara Bio, 北京, 中国）从番茄材料中提取总RNA。使用Vazyme（Vazyme, 南京, 中国）生产的试剂进行cDNA合成和gDNA去除。得到的cDNA储存在-80°C。

4.3. 番茄PEBP家族成员的鉴定从Ensemble数据库（http://plants.ensembl.org/index.html，访问日期为2021年9月4日）下载了番茄、马铃薯、辣椒和拟南芥的基因组序列信息，用于鉴定番茄PEBP家族成员并进行后续分析。从Pfam数据库（http://pfam.xfam.org/，访问日期为2021年9月4日）下载了PEBP的保守结构域（PF01161）[64]。使用HMMER3.0（http://hmmer.org/，访问日期为2021年9月4日）检索番茄蛋白数据，并获取可能的番茄PEBP家族成员。然后，使用HMMER（https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/，访问日期为2021年9月4日）和SMART（http://smart.embl.de/，访问日期为2021年9月4日）在线软件筛选和确认这些基因是否包含保守的PEBP结构域，没有完整结构域的基因被排除。使用REtrotransposedGene EXPlorer排除了伪基因。使用ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/，访问日期为2021年9月4日）预测了SLPEBP的理化性质，如MW（kDa）、等电点、不稳定性指数等，使用Psort（https://www.psort.org/，访问日期为2021年9月4日）预测了SLPEBP蛋白的亚细胞定位。

4.4. PEBP家族基因的染色体位置与复制关系从Solanaceae Genomics Network (SGN)（https://solgenomics.net/，访问日期为2021年9月8日）获取了染色体位置数据，包括染色体长度和基因起始和终止位置。使用TBtools绘制了SLPEBP基因的染色体分布图[70]。使用多重共线扫描工具包（MCScanX）分析基因复制事件，采用默认值[71]。使用DualSysteny Plotter软件绘制了SLPEBP基因家族内的共线关系以及与其他物种中同源于SLPEBP基因家族的基因的共线关系。

4.5. 多序列比对和系统发育分析使用与鉴定番茄PEBP家族成员相同的方法来鉴定拟南芥、马铃薯和辣椒中的PEBP家族成员，并通过使用在线软件筛选保守结构域来鉴定了拟南芥中的7个PEBP家族成员、马铃薯中的10个PEBP家族成员和辣椒中的11个PEBP家族成员。使用MEGA-X对来自拟南芥的7个PEBP家族成员、马铃薯的10个PEBP家族成员、辣椒的11个PEBP家族成员和番茄的12个PEBP家族成员进行了测序，并对结果进行了系统发育分析。分析采用邻接法（neighbor-joining，NJ）和JTT（Jones–Taylor–Thornton）蛋白进化模型，进行了1000次bootstrap重复，并使用其他默认值。

4.6. 基因结构和保守Motif分析使用Gene Structure Display Server 2.0（GSDS）（http://gsds.gao-lab.org/，访问日期为2021年9月15日）绘制了基因结构图[72]。使用MeMe（https://meme-suite.org/meme/tools/meme，访问日期为2021年9月15日）预测了SLPEBP家族基因中的保守motif。预测的motif数量为10个，其他参数为默认值。

4.7. 预测番茄PEBP蛋白的三维结构使用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/，访问日期为2021年10月7日）通过同源建模预测蛋白的三维结构。选择序列一致性大于30%的结构作为模板，并使用SAVESv6.0（https://saves.mbi.ucla.edu/，访问日期为2021年10月7日）评估蛋白模型[78]。选择通过三个或更多评估的模板作为最终模板。使用3D蛋白结构可视化软件VMD（http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd，访问日期为2021年10月7日）进行结构可视化。

4.8. SLPEBP基因家族成员的顺式作用元件分析提取转录起始位点上游2000 bp的序列作为SLPEBP基因的启动子序列，使用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/，访问日期为2021年10月6日）预测启动子序列上的潜在顺式作用元件。对预测结果进行可视化、分类和分析。

4.9. 分析番茄不同组织中的SLPEBP基因表达为了研究番茄不同组织中SLPEBP基因的表达差异，使用番茄品种Heinz 1706的FPKM（每百万外显子映射片段）数据，该数据使用TFGD（http://ted.bti.cornell.edu/，访问日期为2023年4月2日）访问号码D004得到。使用这些数据筛选出12个SLPEBP基因，并分析它们在芽、完全开放的花朵、叶子、根、1cm、2cm和3cm的果实以及成熟绿色、变色和变色+10天后的果实中的表达。为了测量基因的表达水平，基于基因长度和映射到该基因的reads数目计算了每个基因的FPKM值总数。根据每个基因的平均FPKM值对数据进行了归一化处理并绘制了图表。还分析了基因之间的欧氏距离并进行了聚类分析。使用R包pheatmap生成了热图。

4.10. SLPEBP家族成员基因表达的分析使用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/，访问日期为2022年9月4日）设计特异引物，并由BGI Genomics有限公司合成。详细的引物序列信息可以在附表S4中找到。使用南京Vazyme公司的AceQ qPCR SYBR Green Master Mix (无ROX)试剂按照说明书配置成20µL体系，并使用德国Analytik Jena量化PCR仪qTOWER3G进行qRT-PCR分析。详细步骤如下：第一阶段，94 °C 2 min 1个循环；第二阶段，94 °C 15 s，57 °C 15 s，72 °C 30 s 40个循环（扫描）；熔解曲线60 to 90 °C，每10 s增加0.5 °C（扫描）。Actin基因作为内参基因，用作数据标准化的控制。最终计算2−ΔΔ Ct用于分析基因的相对表达。使用GraphPad Prism 9分析方差，并使用单因素方差分析（和非参数或混合方法）进行显著性分析。

5.结论

在本研究中，鉴定并分析了12个SLPEBP基因家族的基因。发现SLPEBP1和SLPEBP9之间存在共线关系。在番茄与土豆间找到11个共线关系，在番茄与辣椒间找到10个共线关系，在番茄与拟南芥间找到4个共线关系。通过进化树的分析和构建，将PEBP基因家族分为三个亚家族，即TFL1、FT和MFT，并总结了亚组的特征。对这12个基因的基因结构和保守模体进行了分析，并总结了它们的一般特征。预测了SLPEBP基因家族的11个成员的蛋白质模型，它们都含有相似的保守结构域。通过对顺式作用元件的预测，进一步分析了SLPEBP基因家族成员的功能。我们推测SLPEBP基因家族成员在植物生长发育、光响应、激素调节和一些非生物胁迫响应中具有功能。组织特异性表达分析显示了SLPEBP基因家族的10个成员在五个不同阶段的表达变化，并验证了它们在植物生长发育中的作用。推测有6个基因（SLPEBP3、SLPEBP5、SLPEBP6、SLPEBP8、SLPEBP9和SLPEBP10）与番茄的开花有关，而有4个基因（SLPEBP2、SLPEBP3、SLPEBP7和SLPEBP11）可能与子房发育相关。以上分析可以为进一步研究SLPEBP基因家族成员提供研究方向和思路。

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编辑于 2023-08-28 16:36