一、文章信息
发表杂志名称：Basic Research in Cardiology
中文标题：2型糖尿病冠状动脉微血管和心肌的单细胞及空间转录组分析
英文标题：Single cell and spatial transcriptomic profiling of the type 2 diabetic coronary microcirculation and myocardium
影响因子：8.0
发表日期：2025年11月7日
二、研究概述
冠状动脉微血管疾病（CMD）是2型糖尿病（T2D）的早期并发症，其核心病理特征包括内皮细胞与平滑肌细胞功能异常、血管重构及力学改变，最终导致冠状动脉血流受损。本研究创新性结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）与空间转录组技术，以T2D db/db小鼠为模型，系统分析冠状动脉微血管、血管周围区域及心肌组织的转录组差异。研究发现，T2D小鼠相关细胞群及冠状动脉微血管富集区域中，脂肪生成、脂肪酸代谢和氧化磷酸化相关基因显著上调，且鉴定出调控这些通路的关键基因（如Angplt4、Ephx2、Hmgcs2等）。这些结果证实，T2D心力衰竭中存在的心脏代谢灵活性受损（线粒体功能下降、脂肪酸氧化依赖增加、葡萄糖利用障碍）会加剧氧化应激和脂毒性，为CMD的靶向治疗提供了新的分子通路和潜在靶点。
三、研究目标
本研究的核心目标是通过整合单细胞与空间转录组技术，解析T2D状态下冠状动脉微血管、血管周围区域及心肌组织的转录组特征，明确参与CMD发生发展的关键分子通路和基因，最终为CMD的机制研究和治疗靶点筛选提供科学依据。
实际要解决的问题包括：
T2D相关CMD的细胞特异性转录组改变尚未明确
冠状动脉微血管与心肌组织的分子互作机制在T2D中如何变化
缺乏针对CMD的精准分子靶点，需通过多组学技术挖掘潜在治疗方向
四、研究方法及目的
4.1 样本与模型构建
| 方法 | 具体内容 | 目的 |
|---|---|---|
| 动物模型 | 雄性T2D纯合子db/db小鼠与对照杂合子Db/db小鼠 | 模拟T2D相关CMD病理状态 |
| 饲养条件 | 12小时光暗周期、22℃、60%湿度，自由进食饮水 | 保证模型稳定性与一致性 |
| 实验时间点 | 16周龄（已建立明确CMD表型） | 聚焦疾病进展期的分子改变 |
4.2 转录组检测技术
| 技术 | 具体操作 | 目的 |
|---|---|---|
| 单细胞RNA测序 | FFPE样本细胞分离、10X Genomics Flex试剂盒建库、Singular Genomics G4测序 | 解析细胞类型特异性转录组差异 |
| 空间转录组分析 | 5μm石蜡切片、10X Genomics Visium芯片捕获、免疫荧光染色定位 | 明确基因表达的空间分布特征 |
4.3 生信分析方法
| 分析类型 | 具体工具/流程 | 目的 |
|---|---|---|
| 数据预处理 | Cell Ranger（质控、比对）、Seurat（过滤低质量细胞） | 获得高质量表达矩阵 |
| 细胞分型 | 无监督聚类（Louvain算法）、标志物基因注释 | 鉴定心脏组织细胞亚群 |
| 差异分析 | Wilcoxon秩和检验、Benjamini-Hochberg校正 | 筛选糖尿病组与对照组差异基因 |
| 功能富集 | clusterProfiler（GSEA、GO分析） | 解析差异基因相关通路 |
| 细胞互作 | nichenetr包、Spearman相关性分析 | 预测配体-受体相互作用 |
4.4 验证实验
| 实验类型 | 具体操作 | 目的 |
|---|---|---|
| 蛋白质组学 | 冠状动脉微血管分离、LC-MS/MS检测 | 验证转录组差异基因的蛋白表达 |
| 免疫组化 | WGA（细胞膜）、α-SMA（平滑肌细胞）、CX43（缝隙连接）染色 | 定位目标区域与细胞类型 |
五、实验设计与结果逻辑
5.1 单细胞转录组图谱构建（figure1）
设计逻辑：首先通过scRNA-seq解析T2D小鼠与正常小鼠心脏组织的细胞组成，明确各细胞亚群的转录组差异，为后续空间定位和功能分析奠定基础
实验流程：分离FFPE样本中的单细胞→建库测序→数据过滤与聚类→细胞类型注释→差异基因筛选与通路富集
核心结果：
共鉴定出11种细胞群，包括内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞、心肌细胞（3个亚群）等
内皮细胞和Slc25a4+心肌细胞占总细胞数的50%以上
所有细胞群中，干扰素α/γ信号相关基因（如Stat1/2、Jak2）显著下调
-
脂肪生成、脂肪酸代谢、氧化磷酸化相关基因在多个细胞群（内皮细胞、心肌细胞、成纤维细胞等）中上调
5.2 空间转录组定位分析（figure2-4）
设计逻辑：基于单细胞图谱，通过空间转录组技术将细胞类型和差异基因定位到组织层面，明确冠状动脉微血管（CRM）、血管周围（PV）和心肌（MYO）三个亚区域的分子特征
实验流程：组织切片制备→免疫荧光染色定位目标区域→空间转录组测序→细胞类型解卷积→区域特异性差异分析
核心结果（按区域划分）：
-
CRM区域（figure2）：糖尿病组Myh7（肥厚心肌细胞标志物）表达升高，免疫相关基因（B2m、Cd74）表达降低；脂肪酸代谢、氧化磷酸化、脂肪生成通路显著上调
- MYO区域（figure3）：与CRM区域一致，干扰素应答通路下调，脂肪酸代谢和脂肪生成通路上调，同时TNFα信号、IL2-STAT5信号通路下调
- PV区域（figure4）：除代谢通路改变外，炎症反应相关通路下调，上皮-间质转化、TGFβ信号通路相关配体-受体相互作用增强
5.3 蛋白质组学验证（figure2E）
设计逻辑：转录组结果需通过蛋白质水平验证，确保差异表达的可靠性
实验流程：分离冠状动脉微血管→蛋白提取与定量→LC-MS/MS检测→差异蛋白筛选
核心结果：
转录组中TOP25差异基因中，12个蛋白的表达趋势与转录组一致且具有统计学意义
仅1个基因的蛋白表达趋势与转录组相反，证实转录组结果的可靠性
5.4 细胞间互作分析（figure5）
设计逻辑：基于单细胞和空间转录组数据，分析CRM区域细胞间的配体-受体相互作用，揭示T2D状态下细胞通信的改变
实验流程：计算细胞类型共定位相关性→筛选高置信度配体-受体对→功能富集分析互作通路
核心结果：
成纤维细胞与平滑肌细胞、内皮细胞等高度共定位，且是主要的配体发送者和接收者
糖尿病组中，成纤维细胞向平滑肌细胞的配体-受体互作显著上调，涉及脂肪生成、TGFβ信号、凋亡等通路
内皮细胞与平滑肌细胞间的信号通信未显著富集，提示成纤维细胞在CMD中的关键调控作用
六、研究总结
本研究首次整合单细胞RNA测序与空间转录组技术，系统解析了T2D小鼠冠状动脉微血管及心肌组织的分子特征与空间分布规律。研究明确了心脏组织中11种细胞群的转录组改变，证实脂肪生成、脂肪酸代谢和氧化磷酸化通路的异常激活是CMD的核心分子机制，并鉴定出Angplt4、Ephx2、Hmgcs2、Pdk4等关键调控基因。通过细胞互作分析发现，成纤维细胞与平滑肌细胞的异常通信可能参与CMD进展，蛋白质组学实验进一步验证了转录组结果的可靠性。这些发现不仅揭示了T2D相关CMD的细胞特异性代谢紊乱机制，还为开发靶向代谢通路或细胞间通信的CMD治疗策略提供了重要的分子靶点和理论依据。未来研究需进一步验证关键基因的功能，并探索性别差异及临床转化价值。
