Nat Biotech | 新技术可在几乎任何位置切割DNA，取代限制性内切酶
原创 图灵基因 图灵基因 2022-10-24 10:35 发表于江苏
收录于合集#前沿分子生物学技术
如果你曾经在分子生物学实验室呆过一段时间，你很有可能打开一个装满限制性内切酶的冰箱。然而，这些日子可能很快就会成为过去，因为CRISPR–Cas核酸酶以可编程方式切割DNA，在体外分子应用方面比限制性内切酶更有优势。
但CRISPR-Cas核酸酶也有其缺陷，特别是需要识别与目标位点相邻的短DNA基序，即原间隔相邻基序（PAM）。对目标位点附近PAM的有效性的依赖阻碍了精确的切割，并限制了DNA底物的序列靶向性。
一项新的研究表明，SpCas9变异体SpRY在体外是无PAM的，可以在几乎任何序列上切割DNA，包括野生型SpCas9无法切割的位点。这项研究由哈佛医学院博士后研究员、马萨诸塞州总医院研究员Kathleen A. Christie博士领导，展示了SpRY DNA digests（SpRYgests）在提高几个克隆工作流程的精确度方面的多功能性和有效性，包括那些用限制性内切酶或典型CRISPR核酸酶无法实现的克隆工作流程。
研究结果发表在《Nature Biotechnology》上的一篇题为“Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests”的文章中。
分子克隆技术的细微差别和挑战一直是许多研究人员争论的问题，包括马萨诸塞州总医院助理研究员、哈佛医学院助理教授、资深作者Ben Kleinstiver博士。Kleinstiver说：“受制于一系列限制性内切酶（它们甚至都不允许在任何你想切割的地方切割DNA）是令人沮丧的。在Keith Joung实验室做博士后期间，我和实习生Nicolas Wyvekens梦想着如何重新利用argonaute蛋白，以实现更简单、无限制的DNA消化。”
尽管其他团队在这一领域取得了进展，但仍存在一些挑战。几年前，当Kleinstiver开始运行他的实验室时，该团队试图构建第一种CRISPR-Cas酶，这种酶可以读取整个基因组，不再需要特定的原间隔区相邻基序（PAM）来编辑DNA。在2020年发表在《Science》杂志上的一篇文章中，该团队展示了SpRY的发展。在这项研究中，kleinstver的团队发现，在人类细胞中，SpRY更喜欢含有NRN PAM的位点，而对含有NYN PAM的位点（N =任意碱基，R = a或G, Y = C或T）的靶向能力较弱。
Kleinstiver说：“从那时起，我们开始意识到，除了在人类细胞中编辑DNA外，我们还可以使用这种酶做很多事情。因此，我们将注意力转向将PAMless SpRY重新用于分子克隆应用，因为SpRY在其gRNA之外缺乏序列要求，原则上应该克服先前方法的不完全重靶向性和其他问题（如限制性内切酶、精氨酸蛋白或常规CRISPR-Cas酶）。”
由Christie领导的研究团队在体外测试SpRY时，惊讶地发现它基本上没有PAM。这一发现克服了在任何特定碱基上切割DNA的剩余障碍。
Kleinver希望该方法能让任何人练习SpRYgests。kleinver说:“寡核苷酸可以从供应商那里购买，gRNA转录试剂盒已经在市场上出售，我们希望很快也可以从供应商那里获得蛋白质（但与此同时，我们已经提供了纯化SpRY酶的细节）。我们希望这种方法的简单性将允许用户将SpRYgests整合到他们典型的分子克隆工作流程中，而不会遇到太多的挑战。”
Kleinstiver设想了一种精简的SpRY工具包，用户只需将一个寡核苷酸插入解决方案中，这也会很方便，从而使SpRYgests能够在各种应用程序中实现。Kleinstiver说：“例如，对于像分子克隆这样的质粒片段互换的典型方法，SpRYgests可以与等温组装方法（即Gibson组装）配对，以简化和提高方法的精度。”
Kleinstiver说，SpRYgest还将简化和加速更复杂的克隆方法，如构建饱和突变库。“由公司合成这些库可能非常昂贵（需要数千到数万美元）。”Kleinstiver说，“我们证明，SpRYgest可以在几天内生成这些库，只需几十美元。”
除了分子克隆之外，Kleinstiver说SpRYgests还可以解锁在任何用户指定位置切割DNA的能力，这对于DNA文库构建或序列缺失（用于下一代测序方法）以及许多其他应用都很有用。
