做过流式实验的同学，对CD4、CD8这两个指标都不会陌生。检测CD4+ T细胞和CD8+ T细胞分型，是流式中最常见的实验之一。

通常，我们会先检测CD3，来圈总T淋巴细胞，再分别用CD4抗体和CD8抗体，来区分CD4+ T淋巴细胞（辅助或调节性T细胞）和CD8+ T淋巴细胞（细胞毒性T细胞）。

上图为新生小鼠脾脏细胞进行的CD3-PE、CD4-FITC、CD8-APC三色流式实验结果。从图中可以看出，在新生小鼠脾脏中，绝大部分细胞是不共表达的单阳细胞，其中约2/3为CD4+CD8-细胞，1/3为CD4-CD8+细胞。

在成熟的T淋巴细胞中，CD4和CD8是互斥的两个指标，因此，在前期配色、后期调节补偿和数据分析的时候，都不太容易出错。通常情况下，二者不共表达，然而有一类CD4、CD8共表达的细胞，却常常被流式新手忽略——胸腺淋巴细胞。

胸腺是T细胞分化、发育、成熟的场所。胸腺细胞是处于不同分化阶段的T细胞。在骨髓中分化出的淋巴细胞样祖细胞，经过血液循环进入到胸腺，在胸腺中完成T细胞的发育，成为成熟T细胞，然后再次随着血液循环，进入到外周淋巴器官。

T细胞的发育，会经历淋巴样祖细胞→祖T细胞→前T细胞→未成熟T细胞→成熟T细胞等阶段，不同阶段的T细胞所表达的抗原不同。根据CD4和CD8的表达来分类，胸腺中的T细胞又可以分为双阴性细胞（DN细胞，double negative cell），双阳性细胞（DP细胞，double positive cell）及单阳性细胞（SP细胞，single positive cell）。

1 前T细胞及之前的阶段都是DN细胞，既不表达CD4也不表达CD8。经过诱导之后，前T细胞快速增殖，开始表达CD4和CD8。

2 此后，细胞进入DP细胞阶段。此时，细胞共表达CD4和CD8，并停止增殖。

3 未成熟T细胞经过阳性选择，进一步分化成SP细胞，即CD4+单阳性细胞或CD8+单阳性细胞。其中，约2/3分化成CD4+细胞，1/3分化成CD8+细胞，在这个过程中，95%的细胞会发生凋亡。

4 经过阴性选择后，SP细胞成为成熟T细胞，通过血液循环进入外周免疫器官。

上图为新生小鼠胸腺CD4-FITC、CD8-APC的流式实验结果。从图中可以看出，在新生小鼠胸腺中，绝大部分细胞共表达CD4和CD8。

本期流式课堂就分享到这里，更多流式实验相关知识可登录Elabscience官方网站查看。