【上一篇为大家介绍了TASS的生物学功能以及研究方法，本篇继续为大家介绍IV分泌系统的效应底物以及转移方式】
上海唯那生物：Type IV secretion system, T4SS知识介绍1zhuanlan.zhihu.com
结构组成
T4SS最少由一组保守的亚基组成。在革兰氏阴性菌中，需要约12个亚基来构建功能齐全的“minimized”系统。根据来自典型根癌土壤杆菌VirB/VirD4 T4SS的T4SS超家族(T4SS superfamily )的统一命名法，这些被命名为VirB1-VirB11和VirD4.
① 三种ATP酶（VirD4，VirB4，VirB11）构成位于易位通道底部的细胞质能量中心，也就是定位于内膜并作为为系统供电的ATP酶，在这些ATP酶中，VirD4在进入转移通道之前充当DNA和蛋白质底物结合的受体，转运的 DNA 呈递给分泌系统的其他组分。
② 通道本身由两个子组件组成，一个组件跨越内膜（inner membrane,IM），另一个组件位于周质和外膜（outer membrane ,OM）中。
③ IM复合物（IM complex,IMC）最少由VirB3，VirB6，VirB8和VirB10的N-末端区域组成。与通道稳定结合的VirB4 ATP酶也被认为是IMC的一部分。
④ IMC通过茎或圆柱体连接到外膜核心复合物（outer membrane core complex,OMCC），其最小程度地由脂蛋白VirB7，VirB9和VirB10的C末端( C-terminal)结构域组成.
T4SS底物和转移信号 (T4SS substrates and translocation signals)
关键词：Dtr proteins（MOB） 、relaxosome、 IV型偶联蛋白（type IV coupling proteins，T4CP）、转移信号（translocation signals，TSs）
VirD4 receptors and substrate docking
VirD4受体几乎与所有的T4SSs相关；少数缺乏VirD4亚单位的系统似乎只在抗原可变（antigenically-variable）菌毛的形成过程或从周质向T4SS输出底物中起作用。
R388编码的TrwB是T4CP超家族的结构原型。根据TrwB的结构和其他生化证据，VirD4受体被认为是具有N末端跨膜结构域（NTD）、保守胞质核苷酸结合结构域（NBD）和与底物结合有关的序列变量全α结构域（AAD）的同六聚体。
一些T4CPs比TrwB（507个残基）大得多，这是由于在一个或两个末端存在序列变量扩展。DotL与嗜肺链球菌T4SSDot/Icm相关，目前是这些较大受体的最佳表征代表。DotL具有约200个残基的C-末端结构域（CTD），该结构域与T4SSDot/Icm转运效应子子所需的衔接蛋白IcmS和IcmW结合。
在过去三年中，在确定衔接子(adaptors)和DotL的CTD对效应子募集的作用方面取得了重大进展。首先，两组报告了DotL CTD(IcmS and IcmW 与 DotN and LvgA)的晶体结构。DotN，IcmW，IcmS和LvgA从CTD的N端到C端连续结合。在假设原子模型中，DotL全复合物由与钟形 CTD /adaptor复合物连接的类TrwB同六聚体组成，其被称为底物受体或识别模块。在该模型的背景下，通过与不同的衔接蛋白接触，大多数或所有效应蛋白被募集到DotL T4CP中。
光交联测定（photocrosslinking assays）的结果证实效应子与IcmS/IcmW异二聚体的细长疏水表面接触。此外，两组现已报道了DotL/衔接子-效应复合物的晶体结构。在一项研究中，提出了与效应物VpdB，SetA，PieA或SidH结合的DotL/IcmS/IcmW/LvgA复合物的原子结构。
值得注意的是，VpdB的~130个残基的C-末端片段由5个α-螺旋组成，其中a1与LvgA的疏水口袋形成特异性和广泛的接触，并且a2-a5形成弱结合LvgA的四螺旋束。SetA，PieA和SidH的C-末端基序类似地结合LvgA的疏水口袋。在LvgA疏水口袋的VpdB和SidH（但不是SetA或PieA）的α-螺旋中鉴定出FxxxLxxxK基序。在生物信息学筛选中，由嗜肺军团菌菌株Philadelphia-1编码的2930种蛋白质中的257种携带该基序，这些46种属于T4SSDot/Icm的已知效应物库。因此，该FxxxLxxxK基序可能构成用于介导与LvgA的特定接触的大部分Dot/Icm效应子的先前未识别的TS。
第二项研究，DotL/受体复合物的纯化产生与DotN，IcmS，IcmW和LvgA结合的DotL，以及DotM和两种先前未知的Dot蛋白DotY和DotZ。建模产生了DotL同六聚体/受体（homohexamer/receptor ）模块的结构，依托于DotM而非IcmS、IcmW或LvgA进行转移的第二效应子集的招募机制提供了新的观点。这些效应子携带上述E-嵌段基序，并且与DotM的E-嵌段接触的建模揭示了效应子与DotL/受体复合物结合的结构基础。总之，这些最新发现大大提高了我们对T4SSDot/Icm通道如何将大量带有不同TSs的效应子进行转移的理解。
在结合DNA或蛋白质分泌底物后，VirD4受体如何介导穿过内膜或细胞质膜的转移？事实上，这仍然是IV型分泌最不了解的方面之一。根据一个模型，VirD4结合并直接将底物穿梭到周质，在那里它们进入VirB通道以通过细胞外部。或者，VirD4募集底物，但随后与VirB4和VirB11 ATP酶协调以处理并通过跨越整个细胞包膜的VirB通道递送它们。对这两种模型都有实验支持，并且由于还没有研究可视化由与VirB通道结合的VirD4六聚体组成的完整T4SS，所以区分它们是复杂的。事实上，二聚体或未指定形式的VirD4亚基显示与同源T4SS结合，但不知道这些机制是否能够进行转移。实际上，有大量证据表明，T4SS在感测到细胞内信号（例如底物对接和ATP能量消耗）以及细胞外信号（例如靶细胞结合）后会经历后期组装或结构转变。进一步定义这种细胞内或细胞外信号如何调节通道组装动力学和底物流动仍然是进一步探索的令人兴奋的领域。
效应蛋白
Translocation signals，TSs
TSs定义为通过效应转运体系统识别蛋白质底物，早期，在C末端发现了两种TSs，一种由带正电荷的簇组成，另一种由疏水残基组成。许多效应子携带这样的TSs，但实际上，不同效应转运体识别的TSs之间存在很大差异，如下所示。
首先，在2015年，C.Farah及其同事在黄单胞菌（Xanthomonas citri）中发现了T4SSs亚家族，该亚家族通过蛋白质毒素的转运促进相邻细菌的杀灭。所有这些效应毒素都携带C-近端TSs，由约120个残基组成，称为XVIPCD（Xanthomonas VirD4-interacting protein conserved domain)。 X.citri VirB/VirD4 T4SS的效应子最初被识别是在与VirD4结合的蛋白质。然而，作为生物信息学筛选的结果，带有XVIPCD基序的候选效应子列表超过了数百个；分散在许多物种中，以黄单胞菌和其他变形杆菌的顺序排列。XVIPCD的特征在于N-末端区域和富含Gln的C-末端区域中的一些保守基序，但尚未指定effector - VirD4 相互作用的性质。
在Bartonella spp中，BEP（Bartonella effector proteins）效应蛋白在感染期间通过VirB/VirD4 T4SS递送到真核细胞中。Bep具有称为BID（Bep intracellular delivery）结构域的C近端TS。BID结构域是序列可变的，但采用由延伸的4-螺旋束组成的保守结构折叠，其有趣地使人联想到由TraM和上述其他Dtr蛋白携带的C-末端α-螺旋结构域。这种结构折叠也涉及VirD4结合，但有趣的是，给定的效应子可以具有分布在整个Bep中的多个BID结构域。此外，BID结构域可通过结合和改变蛋白质功能在真核宿主细胞中赋予效应子功能。例如，BepA的BID1结构域通过结合人腺苷酸环化酶的催化亚基C2以增强cAMP产生来抑制细胞凋亡，从而增强人内皮细胞的增殖。因此，至少有一些BID结构域进化出双重作用，即作为TSs被VirD4受体识别，以及通过结合真核细胞靶来帮助感染的效应子。
嗜肺军团菌Dot/Icm T4SS的早期研究鉴定了许多转移效应子（translocated effectors），其含有由短极性和带负电荷的氨基酸组成的C-末端TSs。生物信息学和实验方法的组合进一步鉴定了至少100个Dot/Icm效应子，其在C末端的17至10个残基内带有谷氨酸残基簇（E嵌段基序，the E block motif），并且在末端附近具有一个或多个疏水性氨基酸。然而，一些具有the E block motif的效应子以及缺乏该基序的其他效应子的易位可以通过衔接蛋白如iCM和IcmW正向或负向调节。Dot/Icm效应子至少有三种方式与T4SSDot/Icm建立关系，E嵌段基序，E嵌段基序与衔接子的结合，或通过结合衔接子以及可能除E嵌段基序之外的TS。现在已经描述了通过与一种或多种衔接蛋白的特异性接触将潜在的大量效应子进入到T4SSDot/Icm通道。
效应DNA分子
Relaxosome - VirD4 (T4CP) interactions
T4SS通道将底物递送穿过细胞膜，但它必须首先将这些底物输送到细胞质入口。通过DNA转移和复制蛋白（DNA transfer and replication proteins，Dtr proteins）的将MGE向同源接合或“mating”通道的聚集，Dtr proteins结合转移起点（origin-of-transfer，oriT）序列以形成松弛体（relaxosome）。
以原子分辨率的技术解决了F质粒编码的TraI松弛酶与其oriT靶序列的相互作用。值得注意的是，TraI含有两个转移信号（translocation signals，TSs），其序列与由在R388，R6112和pKM101质粒转移中起作用的松弛酶携带的TSs相似。指定为TSA和TSB（Translocation Signals A and B）的这些信号不位于F编码的TraI或相关松弛酶的N或C末端，如分泌蛋白的特征性情况；相反，这两个TSs映射到C近端解旋酶结构域，特别是在SF1A/B解旋酶结构折叠的2B/2B样亚结构域内。这些TSs可能有助于松弛体与同源VirD4受体（IV型偶联蛋白（ type IV coupling proteins，T4CP））的结合，但这些相互作用的细节尚不可用。
目前的情况是，许多松弛体组分，包括松弛酶，Dtr因子，甚至转移DNA（translocated DNA），必须结合VirD4， T4CP才能进行特异性和有效的接合DNA转移。
IV型偶联蛋白（type IV coupling proteins，T4CP）
IV型偶联蛋白是异质蛋白家族，具有保守的核苷酸结合结构域（Nucleotide-Binding Domain ，NBD）。几乎所有的T4CP都由TMD和胞质结构域组成。胞质结构域包含NBD，全α结构域（all-alpha domain ，AAD），在某些情况下还包含C-末端结构域（C-terminal domain，CTD）。根据域的体系结构和性质，T4CP分到五个子家族。
VirD4-Type
这是T4CP的第一个描述和研究最多的亚家族。其名称由根癌土壤杆菌T质粒（VirD4At）的T4CP给出。TrwBR388是T4CP家族的原型，包含在这个VirD4型子家族中。VirD4型亚家族包括500-750个残基的膜蛋白，其在N-末端显示至少两个跨膜螺旋。它们之间的序列同一性较低（约15–20%）。
TraG-J对
这些是与VirD4型T4CP具有相似结构的膜蛋白，长度约为700个残基，周质结构域较短。它们之间呈现更高的序列相似性，并且像VirD4型T4CP一样，它们可以在功能上互换。它们需要膜蛋白TraJ相互作用，才可以以执行其功能。TraJ样蛋白的长度约为200个残基，最多可有5个跨膜螺旋。
T4CP缺乏TMD
这个亚家族的成员没有TMD（这个TMD对于大多数T4CP的功能是必不可少的）。然而，这些蛋白质中的一些与小膜蛋白相互作用，形成类似于VirD4型T4CP的复合物。该亚家族中研究最多的两种蛋白质是TraiJPIP501（以前称为Orf10pIP501）和TraIpIP501（以前称为Orf9pIP501）
FtsK型T4CP
ssDNA-SpoIIIE/FtsK的转位酶与T4CPs的结构具有相似性。在FtsK型T4CP的情况下，这种相似性增加。FtsK型T4CP具有超过750个残基，并且几个TMD通过大的接头序列与NBD分开。尽管它们不显示任何AAD，但它们通常具有用于ATP结合和水解的额外结构域。
跨膜结构域(Transmembrane domain):N-末端显示跨膜结构域（transmembrane domain，TMD）
对于VirD4型T4CP，TMD对于体内接合是必需的。该结构域参与T4CP和VirB10蛋白之间的相互作用，这对于T4SS的激活至关重要。此外，TMD对于蛋白质寡聚化至关重要，因为它包含此类过程的关键残基。TMD由α螺旋形成，并包含T4SS相互作用和T4CP功能必不可少的周质环。
TrwBR388的TMD是最广泛研究的。据报道（i）逐步消除TMD元件导致DNA转移的频率降低；和（ii）缺乏TMD的突变蛋白（TrwBΔN70）将导致DNA失去转移活性。
TMD可能在胞质结构域中具有调节功能。例如：通过红外光谱学分析研究TMD对蛋白质结构的影响，观察到TrwBR388在变性条件下（即低离子力，离液剂的存在，高温）比TrwB N70更稳定，因此表明TMD有助于胞质结构域的更紧凑和有序折叠；TMD也对核苷酸结合活性有影响，野生型蛋白对所有核苷酸的结合亲和力较低，但对嘌呤核苷酸三磷酸的特异性较高。
TMD在T4CP中显示出多样化的序列。尽管对VirD4型T4CP的活性至关重要，但缺乏TMD的T4CP能够完成其同源质粒的转移。
胞质结构域 (Cytosolic domain):
核苷酸结合结构域（Nucleotide-Binding Domain ，NBD） 和全α结构域（all-alpha domain ，AAD）
NBD是最保守的域，存在于所有的T4CP中。该域具有两个 motifs；第一个基序，即P环或Walker A，结合磷酸化的β和γ核苷酸。P环基序通常表示为G-x（4）-GK-（TS），其中x可以是任何氨基酸，富含甘氨酸，并具有保守的赖氨酸，其后是丝氨酸或苏氨酸。P环基序存在于许多ATP或GTP结合蛋白中，例如ATP合酶，肌球蛋白，腺苷酸环化酶和ABC蛋白家族的α和β亚基。
第二个基序称为Walker B，其序列表示为（RK）xxxGxxx-LhhhDE，其中x表示任何氨基酸，h表示疏水性氨基酸。拓扑上，NBD位于膜附近，而在结构上，它是由被α螺旋包围的扭曲的β-折叠形成的。这种构象类似于FtsK蛋白的β结构域，FFtsK蛋白是一种在细胞分裂过程中驱动DNA穿过膜的膜蛋白驱动器。NBD对于T4CP的体内活性至关重要。实际上，实际上，Walker A突变体无法完成结合，这可能是由于缺乏ATPase活性。缺乏ATPase活性似乎并未影响突变蛋白的其他特征，例如细胞位置，核苷酸结合亲和力以及与底物的相互作用。这些发现表明，T4CP功能可能发生在核苷酸和底物结合事件之后。
全α结构域（all-alpha domain ，AAD）
AAD面向细胞质并呈现可变大小，序列和折叠模式。该结构域也存在于RecA家族的许多蛋白质中。在T4CPs中AAD会阻断NBD，构象改变后可能参与DNA结合。此外，存在于TrwBR388的AAD中的六个α-螺旋显示出与TraMF的DNA结合结构域相似的拓扑特征，TraMF是与T4CPs相互作用的F-质粒的松弛体的组分。Whitaker等（2015）报道了AAD在细菌结合中的两个重要作用：（i）激活分泌通道；（ii）特异性识别其同源松弛体和辅助蛋白。然后，缺乏同源T4CP的移动遗传元件必须克服这种特异性才能通过异源T4SS转移。
参考文献：
[1] Álvarez-Rodríguez I, Arana L, Ugarte-Uribe B, et al. Type IV Coupling Proteins as Potential Targets to Control the Dissemination of Antibiotic Resistance. Front Mol Biosci. 2020;7:201. Published 2020 Aug 12. doi:10.3389/fmolb.2020.00201
[2] Costa, TRD, Harb, L, Khara, P, Zeng, L, Hu, B, Christie, PJ. Type IV secretion systems: Advances in structure, function, andactivation. Mol Microbiol. 2021; 00: 1– 17. https://doi.org/10.1111/mmi. 14670
相关内容教学：
基于SecReT4 的细菌IV分泌系统分析ke.qq.com
