上期我们谈到铁死亡的“诞生”，文尾我们说作者实验思路非常巧妙。今天，就让我们来看看作者思路究竟“巧”在哪里。

在文章《Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death》中，我们可以看到作者首先给出了Erastin诱导的细胞表型：广泛积累的活性氧ROS(胞质而非线粒体），铁离子依赖。

其次，比较了铁死亡与其他细胞死亡（凋亡，自噬，坏死）的差异，如电镜观察到线粒体形态与其他细胞死亡形式之间的差异，对细胞死亡抑制剂反应性的差异。

细心的小伙伴看到这里可能就有疑问了，既然前面证明了活性氧源于胞质，似乎线粒体在该过程中所起到的作用并不大。这里又提到电镜下线粒体形态改变是区别于其他细胞死亡的显著特征，是不是有些矛盾？

作者之前的工作中提到Erastin可以靶向线粒体的VDAC,但对于铁死亡是必要的，但不是充分的，因此，我们可以认为尽管线粒体活性氧不是铁死亡中活性氧的主要来源，但线粒体对铁死亡是有贡献的。

表型优先，比较差异，这两点算常规操作，不难想到。

接下来就是探究机制，作者并没有一股脑地做转录组，而是有的放矢。尽管线粒体活性氧不是铁死亡活性氧主要来源，但在电镜下观察到显著的线粒体形态改变，于是作者就着重关注线粒体基因变化。

笔者认为这样做有两点好处：

保证实验连贯性，前面将线粒体形态改变作为铁死亡的突出特征，后面若是找到非线粒体相关基因（虽说不是不行，但很可能节外生枝），徒增烦恼。

大大缩小筛选范围，相较于全转录组，线     粒体的基因就少很多。

令人欣喜的是作者的确找到了几个和铁代谢（算是基本解决铁离子问题）以及脂质代谢的基因（算是部分解决脂质过氧化问题）。

这里尝试代入我们自己的角色，如果是我们接下来会怎么做，也许会试着对这些基因沉默或者过表达，结合激动剂抑制剂，寻找信号通路调控机制，最后动物实验进行体内验证。

作者做到这里，虽说一定程度解释了铁死亡的机制，但他觉得这样还不够（活性氧来源问题呢）。

于是运用逆向思维，既然正面难以推进，那就从反面入手，选择铁死亡的抑制剂，研究是如何遏制铁死亡发生的。

作者鉴定出铁死亡的抑制剂ferrostatin-1，进一步探究ferrostatin-1的调节机制时尴尬发现，ferrostatin-1不抑制 MEK/ERK 通路、螯合铁或抑制蛋白质合成。

当然，这也难不倒作者，既然不参与调控，那就研究下ferrostatin-1清除自由基的能力吧（没有领导力，就做个合格打工人吧！）。

一看，果不其然，ferrostatin-1拥有十分出色的脂质活性氧清除能力。

机制似乎走不通，那就加点动物实验看看效果吧。

我们知道铁死亡在神经退行性疾病发挥作用，那么ferrostatin-1是否可以预防这类疾病?

同样的，要是换作我们，选择实验模型可能会选择基因敲除或敲入鼠，抑或注射病毒及药物自行造模。

作者并非如此，他们通过文献了解到：在癫痫、中风和其他创伤情况下发生在神经系统中的兴奋性毒性细胞死亡也被描述为氧化、铁依赖性过程。

于是选择了大鼠海马体切片培养物模型，用谷氨酸进行兴奋性毒性刺激，模拟神经退行性疾病症状（该模型是被报道过的），发现ferrostatin-1或者铁螯合剂能够抑制谷氨酸造成的细胞死亡（选择该模型笔者认为两大优点，一是节省造模时间，二是相对于体内复杂环境，变量单一可控）。

接下来我们看看作者如何上演神来之笔，前人研究发现谷氨酸诱导的脑细胞死亡可以通过离子型谷氨酸受体的钙流入和通过Na +非依赖性胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白系统xc −对胱氨酸摄取的竞争性抑制来启动。

于是作者便将该结论运用到实验中，发现Erastin可以抑制系统xc − 。

文献早已报道抑制系统xc − 阻止了半胱氨酸依赖性谷胱甘肽（GSH）合成并抑制跨质膜半胱氨酸氧化还原穿梭，这是削弱了细胞的抗氧化防御系统（侧面解决活性氧问题，并不直接）。

之前也排除了线粒体电子传递链作为铁死亡中活性氧来源，所以为了正面解决活性氧来源问题，作者检查了NADPH氧化酶在铁死亡中的作用，发现是经Erastin处理细胞中活性氧来源之一。

至此，铁死亡的开山之作便问世了。

我们回顾一下作者实验思路：

1. 提出铁死亡特征-铁离子依赖、脂质过氧化；

2. 与其他细胞死亡进行差异比较；

3.机制分析，基于过线粒体形态改变从而选择线粒体基因分析并找到铁代谢和脂质代谢相关基因；从铁死亡抑制剂ferrostatin-1探寻机制未果，发现ferrostatin-1可以清除脂质活性氧，进一步评估ferrostatin-1在神经退行性疾病作用，巧妙选择谷氨酸刺激海马体切片造模，进一步引出系统xc − ，从侧面解决活性氧问题，更进一步研究其他活性氧生成系统，发现NADPH氧化酶在铁死亡中扮演重要角色。

我们不难发现，作者基于铁死亡特征，从铁离子，脂质，活性氧来源三方面探究机制，虽然均有所发现，三者间更具体的调控关系有待进一步厘清。但不得不说，作者在前期工作的基础上进一步升华了读者对铁死亡的认识。

我们也不得不叹服作者水平高超，无论是通过逆向思维选择铁死亡抑制剂，抑或海马体切片选择，以及最后的隐藏彩蛋(作者有意弱化了RSL3在文章中出现的比重,在后续的一篇Cell文章《Regulation of Ferroptotic Cancer Cell Death by GPX4》中，RSL3出现的比重显著提升），都体现出作者思维敏捷，有的放矢，值得我们借鉴学习。

文章在pubmed可免费阅读，为了规避版权问题，就不放插图了。

参考文献：

1.Dixon, S. J.;  Lemberg, K. M.;  Lamprecht, M. R.;  Skouta, R.;  Zaitsev, E. M.;  Gleason, C. E.;  Patel, D. N.;  Bauer, A. J.;  Cantley, A. M.;  Yang, W. S.;  Morrison, B., 3rd; Stockwell, B. R., Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell 2012, 149 (5), 1060-72.