Nat Rev | 造血干细胞基因治疗的免疫障碍

原创 huacishu 图灵基因 2022-03-23 09:11

收录于话题#前沿分子生物学技术

撰文：huacishu

IF=53.106

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亮点：

1、作者综述了HSC基因治疗在临床适应症应用方面需要克服的大量免疫学问题；

2、作者希望鼓励更多的免疫学家研究和解决当前和下一代HSC基因治疗中的免疫学问题，以实现这种方法在改善人类健康方面的全部潜力。

斯坦福大学医学院Hiromitsu Nakauchi教授课题组在国际知名期刊Nat Rev Immunol在线发表题为“Immunological barriers to haematopoietic stem cell gene therapy”的论文。利用造血干细胞（HSC）进行细胞和基因治疗是再生医学变革的重要部分。最近，涉及自体造血干细胞移植（HSCT）的基因治疗在临床的成功证明了这种干细胞类型的基因工程治疗疾病的潜力。随着CRISPR基因编辑技术、HSC体外扩增方法学和非基因毒性调节方案的完善，基于HSC的基因治疗的临床适应症范围有望扩大。然而，大量的免疫学问题需要克服。其中包括对基因治疗试剂的预先存在的免疫、对通过基因工程引入HSC的新抗原的免疫反应，以及与下一代和现成HSC产品相关的挑战。通过在本综述中综合探讨这些因素，希望鼓励更多的研究来解决与当前和下一代基于HSC的基因治疗相关的免疫学问题，以帮助实现该领域的临床应用。

一种罕见的骨髓细胞群体称为造血干细胞（HSC），负责维持血液和免疫系统的稳态。HSC通过其独特的自我更新和多潜能分化能力来实现这一点。因此，HSC的基因突变（遗传性或体细胞性）表现在广泛的疾病表型中，其中一些直接影响HSC功能，但大多数影响其分化。因此，由于HSC的突变是许多遗传性血液病的根本原因，因此纠正这些导致HSC疾病的突变是至关重要的。HSC移植（HSCT）就是以HSC为基础疗法的这种治疗潜力的一个例子，通过HSC移植，基因健康的HSC被移植到患者体内，以重建一个新的、健康的造血系统。HSCT于1957年首创，已广泛用于血液系统恶性肿瘤的治疗。HSCT还被用于成功治疗广泛的非恶性遗传性血液病，例如，SCID-X1是由IL-2受体-γ（IL2RG）基因突变引起的，该基因阻止淋巴祖细胞（来源于HSC）对IL-2作出反应，从而导致B细胞、T细胞和自然杀伤细胞完全缺乏。将具有IL2RG功能拷贝的HSC移植到SCID-X1患者体内，可产生可分化为T细胞、B细胞和自然杀伤细胞的淋巴祖细胞，并导致疾病的完全纠正（图1）。然而，尽管在临床上取得了几十年的成功，但长期以来，由于需要从人类白细胞抗原（HLA；MHC）谱与患者相匹配的供体中识别异源基因HSC的来源，以避免移植的HSC发生排斥反应，HSCT发展一直受到阻碍。此外，HSCT后可能发生移植物抗宿主病，这是一种危及生命的疾病，具体表现为供体的同种异体反应性T细胞攻击患者的细胞和器官。

为了避免这些对HSCT的免疫障碍，人们在开发基因工程自体HSC的方法方面进行了大量投资，以便患者自己的改良HSC可以作为移植的健康细胞源（图1）。此外，由于HSC相对容易分离和移植，因此HSC是探索细胞和基因治疗潜力的一个易于处理的模型。然而，直到最近，功能性HSC的体外培养仍然具有挑战性，这限制了体外维持和基因操纵HSC的能力。经过几十年的研究，现已开发出体外使用的病毒载体和基因编辑平台，并已成功应用于临床环境中，用于治疗遗传性血液病（图2和图3）。随着对HSC的理解和基因工程方法的成熟，工程HSC的新策略引发了人们对使用基于HSC的基因疗法治疗多种疾病的浓厚兴趣。例如，在不需要损伤DNA的基因毒性调理方案的情况下移植HSC的新技术将扩大基于HSC的基因治疗的使用范围。此外，造血干细胞体外培养的改进为更复杂的基因工程和选择方案以及可扩展的造血干细胞产品打开了大门，从而扩大了患者获得这种治疗的机会。并且，基因工程的进步还应允许采用新的治疗策略，如HSC的体内基因治疗。然而，为了在更广泛的疾病适应症中充分发挥基于HSC的疗法的潜力，必须应对许多免疫学挑战。对基因治疗试剂的先天性和适应性免疫反应仍然是这些平台有效性的一个重要潜在障碍。此外，对通过基因编辑程序引入HSC的新抗原的体内免疫反应的可能性尚未在临床研究中得到解决。在这篇综述中，作者综合了基于HSC的基因治疗的最新进展，并强调了当前和下一代技术的成功需要克服的免疫学挑战。

HSC表达各种模式识别受体（PRR），使它们能够分别通过检测保守的病原体相关分子模式或损伤相关分子模式来检测和响应外来病原体或内源性损伤。这些PRR包括在细胞膜、内体和溶酶体中感应外源分子的Toll样受体（TLR）、检测外源RNA的维甲酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLR）以及检测外源DNA的DNA传感器，如cGAS-STING通路。因此，任何基因治疗试剂的设计和输送都必须使PRR介导的信号通路的激活。慢病毒是一种逆转录病毒，已经成为基于HSC的基因治疗的理想载体，因为逆转录病毒已经进化出许多机制来避免细胞内的先天免疫检测（图3和图4）。例如，病毒RNA的5′端可防止RLR信号的激活，而病毒基因组的直接核导入可将细胞质中cGAS-STING的激活降至最低。然而，慢病毒并不能完全逃避细胞内免疫反应。例如，细胞核中慢病毒DNA的存在已被证明会触发激酶ATM的激活，该激酶ATM在检测游离双链DNA（dsDNA）末端或短单链DNA时起作用。慢病毒介导的ATM激活导致HSC中p53的激活，从而导致p53靶点的上调，如细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21和HSC细胞周期阻滞或凋亡，这已被证明可将转导的HSC的植入潜能降低至少2倍。此外，HSC和其他干细胞对慢病毒转导高度不耐受，部分原因是与分化程度更高的细胞类型相比，它们组成性地表达大量限制性因子有关；例如，HSC表达高水平的干扰素诱导的抗病毒蛋白IFITM1。因此，更好地理解慢病毒触发的先天免疫途径以及如何抑制它们，对于通过增加植入和增加转导来开发更有效的慢病毒基因治疗方案至关重要。例如，已经证明，通过阻断ATM介导的信号传导，抑制p53可增加慢病毒转导的HSC的植入，而环孢素H通过减少IFITM1表达，可将慢病毒转导的HSC增加10倍。对慢病毒转导途径的进一步研究可能会产生更有希望的解决方案，以提高慢病毒介导的HSC基因工程的效率。与基因编辑酶的递送相比，DNA供体的递送刺激HSC中的同源性定向修复已被证明是一个更大的免疫学挑战，因为裸露的双链DNA部分可以触发PRR途径，如HSC中的cGAS–STING途径，导致细胞死亡（图4）。因此，研究了DNA供体模板的替代方法，主要集中在病毒载体上，因为它们已进化为可以逃避细胞内固有免疫反应（图3）。HSC中同源性定向修复的临床相关水平首先通过使用非整合慢病毒载体实现，随后通过使用腺相关病毒（AAV）载体实现。在HSC中，AAV6已被证明对刺激同源性定向修复特别有效，使用AAV6纠正镰刀状红细胞贫血患者血红蛋白-β（HBB）基因突变的临床试验预计将于今年晚些时候开始。然而，AAV载体已被证明能激活细胞中的TLR2和TLR9信号，以及涉及HSC中ATM信号和p53激活的DNA损伤反应，导致病毒转导后HSC植入减少。DNA供体模板的替代来源是单链寡核苷酸（SSODN），其免疫原性有限，但目前只能提供相对较短的DNA序列。进一步研究AAV载体和SSODN引发的先天免疫途径可能会提高基因治疗的效果。

由于用于HSC基因工程的许多试剂都是异种来源的，因此它们有可能被我们的适应性免疫系统识别。目前的HSC基因治疗模式集中于将基因治疗试剂体外输送至自体HSC，然后将其移植回接受基因毒性调节的患者体内。由于这些试剂是在体外输送的，它们与适应性免疫系统的接触被最小化，而且迄今为止，对基因治疗试剂的适应性免疫反应尚未被证明是体外HSC基因治疗临床疗效的主要障碍。为了使体内HSC基因治疗获得成功，必须仔细考虑体内传递的基因治疗试剂的潜在不良反应。在动物模型和人类体内传递基因编辑试剂，可导致其在细胞外环境中被抗体中和。此外，任何以蛋白质形式在细胞内传递的试剂都可以分解成肽，并在MHC I类分子上呈现给细胞毒性T细胞，可能导致T细胞介导的针对转基因细胞的细胞毒性（图4）。如果对基因编辑试剂没有预先存在的免疫力，来自动物模型的证据和体内基因治疗试验（不在HSC中）的临床经验表明，短暂暴露于这些试剂不太可能导致不良免疫反应，因为需要时间对外源抗原产生强大的适应性免疫反应。然而，一旦基因编辑试剂的适应性免疫记忆形成，适应性免疫系统可以对其随后的使用做出快速反应。到目前为止，已有的免疫已被证明是体内基因治疗在临床前和临床研究中应用的一个重大挑战，导致治疗效果的完全抑制。尽管对慢病毒载体的预先存在的免疫力并不常见，但由于暴露于源自这些平台的病原体，对AAV载体和CRISPR–Cas9系统（约60%的成年人中存在）的预先存在免疫力在人群中很常见，其频率和免疫原性水平取决于试剂血清型或物种来源。即使在患者对基因编辑试剂没有预先存在的免疫力的情况下，作为基因治疗的一部分，适应性免疫系统暴露于这些试剂也可能导致免疫记忆反应的发展，从而防止再次给药或将来对同一患者应用基因治疗试剂的可能性。值得注意的是，在自体体外HSC基因治疗的临床试验中观察到了预先存在的免疫问题。最近用VSV-G慢病毒载体体外工程化HSC的临床试验检测到人类HSCT后针对VSV-G的适应性免疫应答的发展，表明适应性免疫系统可以识别体内的基因编辑试剂并对其作出反应，即使它们已在离体环境中应用于细胞。此外，基因治疗试剂生产过程中产生的污染物也会导致我们不希望的适应性免疫反应发生。例如，当在细胞系中产生时，慢病毒载体可以将HLA分子并入其病毒外壳，除非使用无同种异体抗原的细胞系。这些污染的HLA分子可以通过抗体中和载体，或通过T细胞清除转导的细胞。

最近的临床研究成功突出了HSC基因治疗在疾病治疗中的变革潜力。随着高效HSC基因疗法开发的技术挑战得到解决，下一代HSC基因疗法的实施面临新的挑战。目前的体外自体HSC基因治疗模式高度个人化，实施起来极具技术挑战性，因此HSC基因治疗的成本非常昂贵。β-地中海贫血的基因疗法就是一个例子，尽管获得了临床批准，但由于每位患者180万美元的成本，该疗法已从欧洲市场退出。不幸的是，对于正在开发HSC基因疗法的一些主要疾病，如镰刀状红细胞贫血和HIV-1，大多数患者生活在低收入国家，除非有关实施这些疗法的经济问题得到解决，否则很可能无法获得这些疗法。随着自体HSC基因治疗变得更加精简，自动化系统减少了其技术挑战和成本，作者希望这些对自体HSC基因治疗的经济挑战可能会被克服。随着HSC基因治疗领域的发展，先天免疫和适应性免疫都面临着挑战。必须克服这些挑战，才能成功和安全地应用当前和下一代HSC基因疗法。在不久的将来，HSC基因治疗的进展将取决于应对这些免疫挑战的能力。尤其是适应性免疫系统，对下一代HSC基因疗法构成了重大挑战，因为它可能导致引入HSC的新抗原、体内传递给HSC的基因工程试剂或异体HSC的排斥反应。然而，这些策略都没有经过临床测试，需要更多的研究将这些方法纳入HSC基因治疗。通过在本综述中综合这些免疫学挑战，作者希望鼓励更多的免疫学家研究和解决当前和下一代HSC基因治疗中的免疫学问题，以实现这种方法在改善人类健康方面的全部潜力。

教授介绍

Hiromitsu Nakauchi教授就职于斯坦福大学医学院，他通过将免疫学、分子生物学、细胞生物学和发育工程等基础科学的知识和方法与临床医学相结合，致力于发现新的疾病，阐明疾病的原因，并开发治疗模式。最终目标是为建立干细胞治疗的新领域做出贡献，并使干细胞的临床应用成为现实。目前在Nakauchi实验室的工作包括：1.阐明造血干细胞的异质性和层次性；2.活化抗原特异性T细胞以进行有效的免疫治疗；3.通过iPS细胞生成器官。在教育方面，Nakauchi的目标是建立一个个人能够最大限度地利用其兴趣、个性和能力的环境，以培养潜在的研究人员，作为一种人力资源，在生物科学领域进行一系列创造性研究。

参考文献

Charlesworth CT, Hsu I, Wilkinson AC, Nakauchi H. Immunological barriers tohaematopoietic stem cell gene therapy. Nat Rev Immunol. 2022;1-15.doi:10.1038/s41577-022-00698-0