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发表杂志名称：Cell Death and Disease
中文标题：靶向 LHPP 在胃癌新辅助化疗耐药中的作用：基于肿瘤免疫微环境和干性特征的单细胞及多组学数据洞察
英文标题：Targeting LHPP in neoadjuvant chemotherapy resistance of gastric cancer: insights from single-cell and multi-omics data on tumor immune microenvironment and stemness characteristics
影响因子：9.6
发表日期：2025 年 4 月 16 日
研究概述
胃癌（GC）高度异质且复杂，常具肿瘤干性和免疫逃逸机制，导致对新辅助化疗（NAC）反应不佳及治疗耐药。本研究对 375 例来自癌症基因组图谱数据库的 GC 样本和 141 例接受 NAC 的患者临床样本进行单细胞和多组学综合分析。识别出与干性和免疫特征相关的关键基因模块，构建新型干细胞 - 免疫风险评分，该评分能有效区分化疗反应者与非反应者，并与总生存期显著相关。多组学分析揭示磷酸赖氨酸磷酸组氨酸无机焦磷酸酶（LHPP）在肿瘤免疫微环境中的作用，高 LHPP 表达与抗肿瘤免疫细胞浸润增加相关，抑制 GC 干性特征，且 LHPP 通过调节 GSK-3β 磷酸化抑制 GC 细胞干性和化疗耐药。总之，LHPP 在 GC 干性特征和肿瘤免疫微环境中起关键调节作用，有望成为 GC 个性化治疗的生物标志物和潜在治疗靶点。
研究结果
图 1 胃癌患者转录组中干性和免疫特征的综合分析：
作者收集 375 例 GC 样本的 mRNA 转录组测序数据，用 StemChecker 工具和基因本体联盟识别出 35 个干性相关基因集，通过单样本基因集富集分析（ssGSEA）定量分析其富集情况，再用无监督共识聚类算法将胃腺癌患者分为 “高干性” 和 “低干性” 两个免疫亚组，发现两组 mRNAsi 分数差异显著。对 “高干性” 组差异表达基因进行 GO 富集分析，发现除干性相关通路显著富集外，一系列负免疫调节通路也富集。ssGSEA 显示不同干性水平的肿瘤免疫微环境组成存在显著差异。用多种工具评估 GC 中免疫细胞浸润丰度，再聚类将患者分为 “高免疫亚型” 和 “低免疫亚型” 组，经 ssGSEA 和 GO 富集分析验证了免疫分类的可靠性，且发现两个免疫组干性通路富集模式不同，表明 GC 干性与免疫特征密切相关。此外，对 GEO GC 数据库和中心测序数据的分析也验证了上述结果（图 1A - F）。同时，作者找出干性和免疫特征的重叠差异表达基因，进行加权基因共表达网络分析，识别出 7 个基因模块，其中棕色模块的特征基因与 NAC 获益显著相关，该模块还富集了 PD - L1 表达、PD - 1 检查点通路、Wnt 信号通路和 T 细胞受体信号通路等，表明这些通路可能参与 NAC 耐药中干性与免疫的关键相互作用（图 1G - H）。本图结果表明 GC 患者的干性和免疫特征存在明显差异且相互关联，特定基因模块与 NAC 疗效相关。
图 2 干细胞 - 免疫风险评分的建立及其在胃癌患者中的预后价值：
作者从中心接受新辅助治疗的 GC 患者术后标本中收集转录组测序数据，评估肿瘤退缩分级（TRG），将患者分为化疗反应者和非反应者。从棕色模块中选择关键基因，用最小绝对收缩和选择算子算法构建干细胞-免疫风险评分模型，该模型包含 LHPP、PSMA7、TCOF1 和 PRPF3 四个基因。基于此模型将 TCGA GC 患者分为高、低风险组，高风险组总生存期较差。时间依赖校准曲线证实了风险评分对 GC 患者预后预测的准确性。构建包含七个临床特征的列线图指导患者个体化管理，单变量 Cox 回归分析表明干细胞免疫风险评分是 GC 患者的独立预后因素。在 GSE15459 GC 队列中也验证了该风险评分的预后价值（图 2A - J）。本图表明成功构建了与 GC 患者预后相关的干细胞 - 免疫风险评分模型，可用于预测患者术后结局。
图 3 风险评分与耐药、免疫和干性的综合相关性分析：
作者用 pRRophetic 和 oncoPredict 耐药预测算法发现，低干细胞 - 免疫风险评分的患者对多种临床化疗药物反应更好，对 AKT 抑制剂和 Wnt - C59 的药物敏感性更高，表明该风险评分可能反映 Akt/Wnt/β - catenin 信号通路在 GC 化疗耐药中的关键作用（图 3A - B）。用 TIDE 算法评估肿瘤免疫逃逸可能性，发现低风险组中 TIDE 评分低的患者比例显著更高，高风险组中 TIDE 评分高的患者更多，在中心接受 NAC 的 141 例 GC 患者转录组测序数据中也验证了该结果。对中心数据库患者按 TRG 分级和风险评分进行分层分析，发现 TRG 0/1 组患者风险评分显著更低，低风险组患者从 NAC 中获益更大（图 3C - F）。ssGSEA 分析显示，高风险组干性通路富集程度更高，抗肿瘤免疫反应细胞富集程度更低。在 TCGA 和 GSE15459 队列中，HALLMARK 和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析表明，高风险评分与氧化磷酸化、AKT 信号、WNT 信号和代谢过程等通路的富集相关（图 3G - H）。此外，作者分析发现高风险组 ARID1A 突变负担显著更高，高风险组中关键基因 LHPP 所在的 10q26.3 区域拷贝数丢失频率更高，且 LHPP 与风险评分相关性最强（图 3I）。作者还发现 LHPP mRNA 表达与多种抗肿瘤免疫细胞浸润呈显著正相关，中心新辅助测序数据的 KEGG 和 HALLMARK 富集分析表明低 LHPP 表达与抗肿瘤免疫反应通路富集相关，GO 和 KEGG 富集分析显示 LHPP 在肿瘤中通过 PI3K - Akt 信号通路发挥作用，并参与细胞外基质重塑、免疫细胞激活和趋化等生物学过程（图 3J - L）。本图结果表明风险评分与化疗耐药、免疫逃逸及干性相关，LHPP 在其中起重要作用。
图 4 中心新辅助治疗队列单细胞数据中 LHPP 与免疫和干性的关系分析：
作者对中心 10 例接受新辅助治疗患者的术后标本进行单细胞测序，根据标记基因将细胞注释为不同细胞群，并进一步细分 T 和 NK 细胞、髓样细胞和上皮细胞。发现 LHPP 在各种 GC 上皮细胞亚群中广泛表达，在 pit mucous cells 中表达最高。将上皮细胞按 LHPP 表达水平分为两组，用 CellChat 分析细胞间通讯，发现LHPPhigh上皮细胞与 CD8 + 效应 T 细胞相互作用更强，LHPPlow上皮细胞与 CD8 + 耗竭 T 细胞相互作用更强。可视化不同 LHPP 水平上皮细胞与免疫细胞的 MHC I 类和 II 类信号通讯网络，发现LHPPlow上皮细胞主要通过 MHC I 类信号通路与 CD8 + T 细胞通讯，LHPPhigh上皮细胞则主要与 CD8 + 效应 T 细胞通过该通路相互作用，两组通过 MHC II 类信号通路的细胞通讯无显著差异（图 4D - F）。此外，作者对单细胞样本按 NAC 反应进行比较分析，发现反应组中LHPPhigh上皮细胞与 CD8 + 效应 T 细胞通讯显著增强，非反应组中LHPPlow上皮细胞与 CD8 + 耗竭 T 细胞通讯显著增强（图 4G - I）。同时，作者发现 LHPP 和 CD44 在 GC 上皮细胞中的表达呈负相关，LHPPlowCD44high上皮细胞与 CD8 + 耗竭 T 细胞通讯最强，LHPPhighCD44low上皮细胞与 CD8 + 效应 T 细胞通讯最强（图 4J - K）。本图表明 LHPP 表达水平影响上皮细胞与免疫细胞的通讯，进而影响肿瘤免疫微环境和对 NAC 的反应。
图 5 LHPP 在体外抑制胃癌细胞干细胞样特征：
作者根据不同 GC 细胞系中 LHPP 的表达水平，建立 LHPP 过表达的 AGS GC 细胞和 LHPP 敲低的 MKN45 GC 细胞系。发现低 LHPP 表达导致 GC 细胞系中干性标记蛋白 CD44、NANOG、SOX2 和 SOX9 水平显著增加，高 LHPP 表达则抑制这些干性标记的表达（图 5A - C）。3D 球体形成实验表明，LHPP 过表达降低 AGS 细胞的球体形成能力，显著降低 CD44 表达；LHPP 敲低则增强 MKN45 细胞的球体形成能力，显著增加 CD44 表达（图 5D - E）。流式细胞术分析显示，高 LHPP 表达显著降低 CD44 阳性 GC 细胞比例，低 LHPP 表达则显著增加该比例（图 5F - G）。极限稀释实验表明，LHPP 敲低细胞的球体形成能力显著增强，LHPP 过表达细胞的球体形成能力显著降低（图 5H - I）。患者来源的类器官实验表明，LHPP 过表达病毒转染的类器官直径显著减小，LHPP 敲低病毒转染的类器官直径显著增大（图 5J - K）。进一步研究发现，低 LHPP 表达通过 GSK - 3β 磷酸化介导 GC 细胞的干细胞样特征，添加磷酸化 GSK - 3β 抑制剂可显著逆转 LHPP 低表达细胞增强的球体形成能力和类器官中的干细胞样特征，而磷酸化 GSK - 3β 激活剂则逆转 LHPP 高表达细胞降低的球体形成能力（图 5L - M）。本图结果表明 LHPP 在体外能显著抑制胃癌细胞的干细胞样特征，且该作用与 GSK - 3β 磷酸化相关。
图 6 LHPP 下调增强胃癌细胞干细胞样特征和化疗耐药性：
作者通过裸鼠和野生型 C57BL/6 小鼠的极限稀释实验评估 LHPP 对肿瘤干性的影响。在裸鼠实验中，与对照组相比，LHPP 过表达的 AGS GC 细胞肿瘤形成率和数量显著降低，肿瘤重量和体积也减小；LHPP 敲低的 MKN45 GC 细胞肿瘤形成率和数量显著增加，肿瘤重量和体积增大（图 6A - D）。在野生型 C57BL/6 小鼠实验中，过表达 Lhpp 的 YTN5 小鼠 GC 细胞肿瘤形成率、数量、重量和体积均显著低于对照组，敲低 Lhpp 的 YTN3 小鼠 GC 细胞则相反（图 6E - F）。此外，作者在人 GC 类器官中添加奥沙利铂（OXA），发现 LHPP 过表达的类器官在 OXA 处理后大小和存活率显著降低；在 GC 细胞系中添加 OXA，流式细胞术分析显示 LHPP 过表达显著增加 GC 细胞在 OXA 处理后的凋亡率，LHPP 敲低则相反（图 6G - H）。本图表明 LHPP 下调可增强胃癌细胞的干细胞样特征和化疗耐药性，LHPP 在体内外均对肿瘤生长和化疗敏感性有重要影响。
图 7 肿瘤中 LHPP 的表达与干性特征、抗肿瘤免疫微环境和预后相关：
作者用条件敲除基因小鼠模型比较 GC 中 Lhpp、Cd44 和 CD8 的表达和分布，发现低 Lhpp 表达区域 Cd44 表达显著增加，且 Cd44 与 Lhpp 定位相互排斥，同时该区域 CD8 + T 细胞浸润减少；高 Lhpp 表达时，Cd44 表达显著降低，CD8 + T 细胞浸润显著增强（图 7A - D）。对患者 GC 术后标本进行免疫组化分析，发现高 LHPP 表达与良好预后相关，高 CD44 表达与不良预后相关，LHPP 与 CD44 表达呈显著负相关。综合分析 LHPP 和 CD44 表达，发现高 LHPP 低 CD44 表达与更好的生存预后相关，低 LHPP 高 CD44 表达与不良生存预后相关（图 7E - G）。此外，作者将患者分为 “炎症”“排除” 和 “荒漠” 三个免疫组，评估肿瘤中心和侵袭边缘的 CD8 + 免疫细胞表达，发现三个免疫组中 LHPP 表达存在显著差异，“炎症” 组 LHPP 表达明显更高。定量评估肿瘤免疫细胞浸润发现，高 LHPP 表达与肿瘤中心和侵袭边缘的 CD3 + 、CD4 + 、CD45 + 和 CD8 + T 细胞浸润丰度呈正相关（图 7H - I）。本图表明 LHPP 表达与肿瘤干性、免疫微环境和患者预后密切相关，可作为预测患者生存结局和免疫状态的潜在生物标志物。
本研究通过对大量胃癌样本进行单细胞和多组学分析，深入探究了胃癌新辅助化疗耐药机制。研究识别出与肿瘤干性和免疫特征相关的关键基因模块，构建的干细胞-免疫风险评分可有效区分化疗反应者与非反应者，并预测患者预后。多组学分析发现 LHPP 在肿瘤免疫微环境中发挥重要作用，高 LHPP 表达与抗肿瘤免疫细胞浸润增加相关，抑制肿瘤干性特征。机制研究表明，LHPP 通过调节 GSK - 3β 磷酸化抑制胃癌细胞干性和化疗耐药。在小鼠模型和临床样本中进一步验证了 LHPP 的作用，其表达与患者预后和免疫细胞浸润特征显著相关。总之，LHPP 有望成为胃癌个性化治疗的生物标志物和潜在治疗靶点，但本研究存在样本量有限等局限性，未来需扩大样本量并深入探究其调节免疫微环境的具体机制，以推动其临床应用。
