文章标题：Mechanism study of phthalate exposure promoting endometriosis: Based on the ferroptosis perspective
文章主题：邻苯二甲酸酯（PAEs）暴露促进子宫内膜异位症（EM）的机制研究
发表期刊：Journal of Hazardous Materials
影响因子：11.3
组学技术：单细胞转录组、空间转录组、Bulk RNA-seq
研究背景
邻苯二甲酸酯（PAEs）是广泛存在的环境内分泌干扰物，可通过多途径暴露并与子宫内膜异位症（EM）发病风险相关，但具体分子机制尚不明确；铁死亡是 EM 的关键病理过程，而 PAEs、铁死亡与 EM 三者间的关联研究仍不足，本研究旨在从铁死亡视角系统揭示 PAEs 暴露促进 EM 发生发展的分子机制。
研究路线
研究结果
1. 筛选邻苯二甲酸酯暴露下子宫内膜异位症中差异表达的铁死亡相关基因
首先从ChEMBL、CTD、SwissTargetPrediction及PharmMapper数据库共获取5325个邻苯二甲酸酯（PAEs）靶点，从 GeneCards、OMIM、TTD及DrugBank数据库获得2440个子宫内膜异位症（EM）相关靶点，二者交集得到929个PAEs-EM预测靶点。随后以GSE51981数据集（71例正常样本、77例EM样本）为训练集，识别出2370个差异表达基因（DEGs），含1199个上调基因、1171个下调基因。加权基因共表达网络分析（WGCNA）将基因划分为10个模块，其中绿松石模块与EM相关性最高，该模块基因与DEGs交集得到2215个EM相关差异基因。最后将上述基因与铁死亡数据库（FerrDb）中的铁死亡相关基因（FRG）取交集，筛选出10个在PAEs暴露下EM中差异表达的铁死亡相关基因（PAEs/EM-FRG）。
2. PAEs/EM-FRG富集于氧化应激与上皮-间质转化相关通路
上述10个核心基因（TFAM、TGFB1、ARF6、EZH2、HSPA5、JUN、AKR1C3、MAPK3、PIK3CA、SLC11A2）均为PAEs作用靶点且兼具EM相关表达特征与铁死亡属性，基因间存在共表达模式，共同参与EM进展中的铁死亡调控。GO富集分析显示，这些基因主要富集于活性氧应答、氧化应激反应、上皮-间质转化（EMT）正向调控、上皮细胞迁移、干细胞发育等通路；KEGG 分析则提示其与铁死亡、子宫内膜癌、孕激素介导的卵母细胞成熟等过程密切相关。
3. ARF为邻苯二甲酸酯暴露下的关键铁死亡相关基因
为筛选PAEs暴露下促进EM的核心基因，本研究采用12种机器学习算法（XGBoost+Lasso+RF最优组合）对PAEs/EM-FRG进行筛选。Lasso算法筛选出8个候选基因，随机森林（RF）筛选出5个，XGBoost筛选出4个，三者交集仅ARF6。进一步对5例EM患者与5例正常女性子宫内膜组织进行免疫组化（IHC）与免疫荧光（IF）验证，结果显示EM组织中ARF6表达显著高于正常组织，证实ARF6是PAEs暴露下驱动 EM 的关键铁死亡相关基因。
4. ARF6 在子宫内膜异位症中与上皮-间质转化相关细胞共定位
单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析显示，正常样本以上皮细胞（Epi）为主，EM样本中间质细胞（MSCs）占比更高，符合EMT特征。单细胞水平证实ARF6在Epi与MSCs中均有表达；免疫荧光共定位实验显示：正常组织中ARF6与上皮标志物EPCAM共定位、低表达，EM组织中ARF6与间质标志物COL1A1共定位、高表达（图 5G），提示ARF6表达与定位转变直接驱动EMT。
5. ARF6 表达与上皮细胞干性正相关
将上皮细胞分为SOX9、腔上皮（Lumenal）、腺上皮、纤毛上皮（Ciliated）4个亚型，正常组织以腔上皮、纤毛上皮为主，ARF6主要在腔上皮、腺上皮中表达。CytoTRACE干性分析证实腔上皮、纤毛上皮干性最强，且ARF6表达与二者干性呈显著正相关，提示ARF6通过增强上皮细胞干性促进EMT。
6. 间质细胞具有高上皮-间质转化能力
将间质细胞分为子宫内膜基质细胞（EnS）、成纤维细胞（Fibros）、平滑肌细胞（SMCs）3个亚型，EM组织中成纤维细胞占比最高，ARF6主要在成纤维细胞中高表达。基因集变异分析（GSVA）显示，成纤维细胞EMT能力最强，为EMT的关键效应细胞。
7. ARF6介导上皮-间质转化、促进成纤维细胞分化
拟时序分析证实：正常组织的腔上皮、纤毛上皮可定向分化为EM组织中的成纤维细胞，完成EMT过程。随伪时间进展，成纤维细胞EMT标志物（CDH2、SNAI1）表达逐渐升高，且ARF6表达与CDH2、SNAI1水平呈显著正相关；免疫荧光证实ARF6与CDH2在EM组织中共定位，直接证明ARF6驱动成纤维细胞分化、促进EMT。
8. 空间转录组联合免疫荧光验证子宫内膜异位症中的上皮-间质转化
空间转录组显示，EM组织中上皮标志物CDH1下调、间质标志物CDH2上调，发生钙粘蛋白转换（EMT典型特征）。免疫荧光证实：正常组织中ARF6与上皮标志物CDH1共定位；细胞通讯分析显示，TGFβ、WNT、NOTCH通路及IL6信号在腔上皮与成纤维细胞间介导关键互作；空间距离分析证实腔上皮与成纤维细胞空间位置最近，拟时序分析进一步支持二者定向分化关系，从空间维度证实ARF6介导的EMT。
9. ARF6敲除模拟揭示其对铁死亡的调控网络
采用scTenifoldKnk算法对EM成纤维细胞进行ARF6虚拟敲除，发现23个铁死亡相关基因表达显著改变，功能富集显示这些基因参与氧化应激应答、蛋白磷酸化调控、细胞黏附、伤口愈合等过程，证实ARF6通过调控铁死亡相关通路，介导EMT过程中的铁死亡。
10. 邻苯二甲酸酯与关键铁死亡靶点ARF6的分子对接
分子对接结果显示，7种常见 PAEs（DMP、DEP、DiBP、DBP、DEHP、DiNP、DOP）与ARF6结合能均＜-5 kcal/mol，结合亲和力强，证实PAEs可直接结合并激活ARF6，启动下游致病通路。
结论与意义
综上所述，本研究将ARF6确定为PAEs暴露下的关键FRG蛋白，并从多维度论证了其在子宫内膜异位症（EM）发病机制中的重要作用。尤为重要的是，我们构建了EM中“管腔细胞+纤毛细胞→纤维化”的EMT转化模型，将EMT研究的重点从“混合细胞”转向“特定亚型细胞”。通过整合PAEs与EM之间的作用网络，本研究提出了“PAEs-铁死亡-EMT-子宫内膜异位症”轴，并揭示了ARF6在此过程中的中介作用，从而将环境暴露促进疾病发展的理论从“宏观关联”提升至“微观机制”层面。这些发现不仅基于“AEs-EM”轴为EM提供了新的治疗靶点，更为EM的防治提供了环境暴露预防的新视角。
