GATK4.0之后和之前的版本存在较大差异，因此需要使用特定版本来call变异时需要有较大的改动，call变异的过程更趋向于流程化。
首先是软件安装
在github中下载gatk 4.1.7
wget https://github.com/broadinstitute/gatk/releases/download/4.1.7.0/gatk-4.1.7.0.zip
unzip gatk-4.1.7.0.zip
将zip包解压之后修改环境变量并保存。
注：这里使用的samtools版本为1.6。
GATK使用说明
## 帮助信息
gatk --help
## 列出所有的工具
gatk --list
## 工具的说明，比如以VariantAnnotator 为例
gatk HaplotypeCaller --help
GATK call变异简单流程
1. 数据准备
- ref.fa
- reads1.fq.gz
- reads2.fq.gz
建立索引
bwa index ref.fa
samtools faidx ref.fa
gatk CreateSequenceDictionary -R ref.fa -O ref.dict
2. BWA比对
#使用bwa mem比对算法
bwa mem -t 20 -M -P -R '@RG\tID:20ZS0002_clean\tSM:20ZS0002_clean\tLB:20ZS0002_clean\tPL:Illumina' reference.fa 20ZS0002_clean.out.1.fq.gz 20ZS0002_clean.out.2.fq.gz >20ZS0002_clean.sam
# -t为线程数，-R指定引号内的flag信息。ID一定要每个样本对号入座，SM号、LB号可与ID号一样，PL为测序平台，一般为Illumina
3. 用samtools将sam转换成bam
samtools view -bS 20ZS0002_clean.sam -o 20ZS0002_clean.bam
#sam转bam
samtools sort 20ZS0002_clean.bam -o 20ZS0002_clean.sort.bam
#对bam进行sort排序
4. 标记PCR重复
java -jar picard.jar MarkDuplicates REMOVE_DUPLICATES=false \
MAX_FILE_HANDLES_FOR_READ_ENDS_MAP=8000 \
INPUT=20ZS0002_clean.sort.bam OUTPUT=20ZS0002_clean.marked.bam \
METRICS_FILE=20ZS0002_clean.marked.bam.metrics
5. 将标记好的bam排序
samtools index 20ZS0002_clean.marked.bam
6. GATK call 变异
gatk --java-options -Xmx8G HaplotypeCaller -R ref.fa -I 20ZS0002_clean.marked.bam \
-O 20ZS0002_clean.g.vcf.gz -ERC GVCF --max-mnp-distance 0
#生成中间文件gvcf文件（gvcf格式包括所有的变异类型，包括SNP和InDel，需要进一步过滤）也就是说现在每个样本一个gvcf文件
7. 将gvcf文件进行整合
gatk --java-options -Xmx256G CombineGVCFs -R ref.fa \
--variant 20ZS0002_clean.g.vcf.gz \
--variant 20ZS0003_clean.g.vcf.gz \
--variant 20ZS0005_clean.g.vcf.gz \
-O All_samples.g.vcf.gz
8. 提取基因型
gatk --java-options -Xmx256G GenotypeGVCFs \
-R ref.fa -V All_samples.g.vcf.gz -O genotype.vcf.gz
9. 提取SNP
gatk --java-options -Xmx256G SelectVariants \
-R reference.fa -O SNPs.vcf --variant genotype.vcf.gz \
--select-type-to-include SNP
# 同理，也可以提取indels
10. 对SNPs进行过滤
按照官方默认参数即可
gatk VariantFiltration \
-V SNPs.vcf \
-filter "QD < 2.0" --filter-name "QD2" \
-filter "QUAL < 30.0" --filter-name "QUAL30" \
-filter "SOR > 3.0" --filter-name "SOR3" \
-filter "FS > 60.0" --filter-name "FS60" \
-filter "MQ < 40.0" --filter-name "MQ40" \
-filter "MQRankSum < -12.5" --filter-name "MQRankSum-12.5" \
-filter "ReadPosRankSum < -8.0" --filter-name "ReadPosRankSum-8" \
-O SNPs_filtered.vcf
