摘要
在驯化植物中一个普通反复发生的主题是梨形果实的发生。一个主要的控制从圆到梨形果实的转变的数量性状位点（叫ovate）已经从番茄中克隆出来。OVATE在花和果实发育中表达，编码一个以前没发现的，亲水性蛋白，带有一个假定的二部核定位信号，Von Willebrand因子类型C结构域，和一个大约为70aa的C端在番茄，拟南芥和水稻中保守的结构域。一个导致提前的终止密码子的单突变导致番茄果实的从圆到梨形的转变。更重要的是，异常的转基因的ovate表达不均衡的减少花器官和叶子的大小，这认为在植物发展过程中，OVATE代表之前没有发现的负调控蛋白。
引言
坐果作物的植物已经被驯化成一系列的野生植物种类。水果作物驯化的重要标志之一在果实形状变化上出现变化，也就是这种变化经常决定着坐果作物。尽管它的历史的和经济的重要性，对果实形状变异的分子机理很大程度是还不清楚。梨形果是最普通重现的果实性状之一。尽管在野生种的不常见，在现代各种各样的番茄、茄子、甜瓜、南瓜、粒和其他果实植物中，梨形果实能够被发现。然而，关于梨形果实的本质很少知道，除了偏离球形正常增长的分子事件明确出现在花发育的早期。
梨形果实拥有一些和野生表型果实表型不一样的表型。而野生的表型拥有圆形的带着分布与果实中心的种子果实，梨形果实是长的带着明显的脖子收缩和不对称的朝向一端果实分布的种子。在早期关于番茄遗传的研究，ovate作为一个在2号染色体上调控梨形番茄果实形状的单隐形基因被描述。最近的遗传分析已经鉴定ovate作为一个主要的在番茄和茄子上调控梨形果实发育的QTL。
为了阐明分子分子基础和遗传损伤的参与的梨形果实的生成，我们已经从番茄中克隆了ovate位点。蛋白注释，超量表达研究和ovate隐形的本质表明ovate代表着在植物发育中一类没有鉴定到的负调控重要蛋白。
结果
遗传的和物理的精细定位OVATE区域
之前我们已经鉴定一个拥有一个主要的与ovate的果实变长和脖子收缩表型相关在2号染色体区域在TG645分子标记附近的QTL的区域。TG645用于筛选一些番茄细胞人工染色体文库，文库鉴定了一个名叫BAC19的包含一个覆盖ovate区域的105kb基因组DNA产物BAC克隆。
BAC19克隆的测序表明17假定的ORFs。在BAC19序列的基础上，分割的多态性序列和单核苷酸标记被开发，并用于鉴定ovate区域两侧最接近的交换区域。这将ovate缩小到一个包含8个ORFs的55-KB间距。
OVATE候选基因的鉴定。
为了鉴定那个导致梨形的特别基因，覆盖55-Kb区域的DNA片段从一个野生表型的番茄中通过PCR被扩增和测序。这个序列和来自ovate表型的相同区域的序列的比较发现2个SNP和一个2bp的插入和缺失。这个插入或缺失和SNP定位于非编码区域，然而第二个SNP，在ORF6的第二个外显子上，在ovate基因型上导致了一个提前终止密码子，导致在预测蛋白的C端的一个75aa短截。提前终止密码子的发生，这将导致一个功能部分或完全的缺失，符合在ovate位点上观察到的等位基因互作。梨形等位基因对野生表型是隐形或半隐形的。因此，ORF6被认为是一个很可能的ovate的候选基因。
支持这个假设的更多证据来自于一些梨形番茄突变材料的ORF6的测序，包括TA305,LA791和LA0025。所有的都表明支持鉴定的ORF6序列，包括提前的终止密码子，这表明这些梨形的品种对ORF6有一个共同的祖先的等位基因。
从一个之前的作图群体汇中分支的一个同源自交系拥有一个不常见的ORF6，作为一个在ORF6唯一的内含子中的交叉的结果。5端调控区域和第一个外显子来自于野生和圆的果实形状，而第二个外显和下游区域来自于OVATE表型。TA1792产生了梨形的果实，更加确认了在ORF6的第二外显子的提前终止密码子复责ovate的表型。
通过ovate的梨形果实表型的互补
为了证明ORF6是ovate基因，一个基因组包含ORF6和5’和3’区域的DNA片段从TA496中扩增出来，并克隆进二元载体中。另外，超量表达载体也被产生，在这个载体中TA496的ORF6的编码区域被克隆进二元载体体中，在CaMV-35S启动子之后的一个正方向。这两个载体，还有对照载体，分别被转进TA503植株中，植株含有ovate等位基因和正常产生的梨形果实。
获得10个独立的T0转化植株，在10株中，梨形表型被转成圆的和半圆的：3个和7个转基因植物分别被自身和35S启动子驱动。自身启动子转基因植株的盛花期花朵显示TA503的表型恢复：带着轻微脖子收缩的稍微伸长的心室和心室朝果实一段不规则的放置。然而，授粉之后，这个系的果实逐渐变得更圆指导成熟，单花中的大部分带着位于果实中心的心室的果实是圆的。仅仅在花序中的最后的果实表现出轻微的梨形表型。在超量系中，一个梨形果实表型完全恢复在授粉之前被证明了。这个结果清晰的表明ORF6互补了果实变长和果实脖子收缩的表型，表明这就是ovate基因。
Overexpression of OVATE ConfersAbnormal Phenotypes to Tomato Plants.
超量表达OVATE基因表型出不正常的表型
为了产生圆的果实，超量表达系表现出一系列不正常的表型，包括凸出的柱头，缓慢的植物生长，改变的植物和花的形态。这些超量表达系的所有花器官比他们的非转基因或者自身启动子的对应部分。然而，花萼和雄蕊最受影响，显示出超过30%-60%的减少，当和花瓣和雌蕊相比较时。另外，缓慢的植物生长和更小的复杂叶大小好像与强的超量表达株系有关系。在中等和强的系中，小叶变得更圆，锯齿变得不明显。这些结果表明OVATE是植物生长的抑制子，并且突出的雌蕊表型是因为不同花器官的不平衡的抑制造成的。超量表达ovate没有显著影响雄性和雌性的育性，在人工授粉之后，超量表达的所有植株带有正常种子的果实。
OVATE Is Expressed in ReproductiveOrgans in Early Stages of Flower and Fruit Development
ovate在开花早期和果实发育的生殖器官中表达
有超过15000番茄EST数据在公共数据库中，大部分是来自开花和果实RNA构建的cDNA文库。这些数据的筛选表明没有带着匹配OVATE的EST。更重要的是，OVATE的信息没有在叶、花或者果实发育的各个阶段通过Northern检测到。因此，RT-PCR被用于在TA503定量OVATE转录本和TA496植株。在图4中显示，OVATE主要在生殖器官中表达，在营养器官中不能检测到表达水平，包括幼叶和茎尖。OVATE转录本在开花前10天到开花后8天在发育的果实中能够被检测。并且在些时间上，ovate的转录水平开始下降。在上游区域的1334bp出一个16bp的indel可能是TA503和TA496之间OVATE表达的轻微差异的原因。因为在梨形系中受精之前梨形就被证明在子房之中。TA503，与ovate表达和果实表型一致，更深入表明空间上限制OVATE的表达也许导致在果实脖子区域限制生长。
OVATE Encodes a Previously Uncharacterized Class ofRegulatory Genes Important for Plant Development
ovate编码一个之前没有被鉴定的一列对植物生长发育重要的调节基因
通过RT-PCR和3’RACE获得OVATE的全长互补序列，基于这些序列，ovate被预测编码一个40.7-kDa疏水性蛋白带着一个假定核定位信号。2个假定的VWFC蛋白蛋白互作结构域和一个70aa羧基端在番茄、拟南芥和水稻保守的结构域。在翻译上那个发生在ovate等位基因的提前的终止将消除了这个保守结构域的大部分，这表明它的重要功能，并解释了失去功能的隐形表型通过ovate的表型。这个在其他物种中的OVATE的同源物也包含VWFC结构域和NLS在不保守区域中。
讨论
OVATE作为一个植株生长抑制子发挥功能
在目前的研究中，我们鉴定和克隆了果实形状基因，OVATE，这决定了番茄果实从圆到梨形的转变。这些果实形状特点之间的形态差异是明显的和复杂的，并可能是由于在番茄果实中细胞分裂和细胞分化的良好的调控。
OVATE是重要的扮演着，在这种转变提供能源。早期的遗传研究表明，在ovate中的隐形突变
导致梨形番茄的果实形状。OVTE等位基因的序列对比表明所有检测的梨形番茄品种表明相同的有义突变导致预测蛋白的短截，这也能够解释这些等位基因功能缺失的本质。纯合重组系，TA1792，有一个怪异的OVATE等位基因，产生梨形的果实。表明来自梨形果实等位基因的第二个外显子的突变足够解释果实形状的转变。合起来，这些结果表明OVATE的野生形式，阻止了梨形果实的形成。因为梨形果实的产生能够简单的考虑为来自一个圆形果实的脖子区域的生长的影响，OVATE可能是在果实脖子区域的一个抑制子。
一个包含野生型圆果等位基因的OVATE能够明显恢复TA503的梨形表型，认为OVATE是足够抑制故事脖子的长出。OVATE转基因和遗传的表达不仅在梨形系中完成恢复原形表型到圆的果实表型，也生长的抑制和营养和生殖器官的形状改变。有趣的是，在强的超量系中，通过组成型表达OVATE，果实大小和种子发育没有受到影响。表明不同的器官对OVATE响应不一样。这个结果也表明被OVATE的生长抑制很有能通过一个不是特定毒性在基本的细胞过程、所有器官对超量表OVATE的一致反应。
在自启动子转基因系中，通过OVATE，早期的果实很好的互补，要比来自于梨形果实的单花序的晚期果实好，这表明OVATE不仅仅在转录水平被调控，这样通过发展的线索被调控。在萼片中OVATE的表达模式将更多的解释OVATE表达和他们功能之间的联系。
OVATE可能抑制一个之前没有鉴定的一列调控植物生长的基因。OVATE编码一个和数据库中和任何已知功能蛋白没有任何比对的蛋白。序列比对和数据库查找表明OVATE包含一个双边的NLS，蛋白互作结构域和一个植物系统保守的C-端结构域。OVATE和在番茄和其他植物物种中的假定同源物仅仅在保守的C-端结构域分享着序列的相似性。在检测的梨形ovate等位基因的有一突变丢失了预测蛋白保守结构域的大部分。然而，在不保守的区域，OVATE的同源物也占有着而分NLS和或VWFC结构域，表明这些基因的结构重排的重要性。由于OVATE预测编码一个疏水蛋白带着一个假定的核定位信号和对植物生长的光谱影响，他可能代表着一类之前没鉴定的对植物生长发育重要的调控基因。在番茄和其他植物物种汇总这些基因功能的进一步遗传和生化研究对他们在植物发育的角色将提供一个好的概况。
Modulation of a Few Major Regulatory Genes Can FuelDramatic Morphological Changes During Evolution and Domestication
一小部分重要调控基因的突变能够给在进化和驯化过程中的显著形态变化助力
野生植物果实通常在形状上是小和圆的，这能帮助种子通过野生动物传播。驯化已经极大的增加果实作物的植物果实的形状和大小的多样性，并伴随着其他的变化。像整体的生理反应和是一个自然环境。最近，一个理论，在进化和驯化过程中，主要形态改变使由于一部分重要影响的主要调控基因而不是许多只能引起小的影响改变的基因导致的。
例如，在BoCAL 的有意突变解释了花椰菜的驯化，玉米的TB1基因是一个重要的调控基因，控制着野生玉米的形态到现代玉米的转变。
在目前的研究中，我们说明了一个单基因的有意突变能够解释由圆果到梨形果的转变。目前关于果实形状发育进化的研究为调控理论的研究提供了额外的证据。
PS：该文章为果实果形发育的经典文章，对基因的克隆、功能验证、表型描述和功能推测讨论是很好的模板作用！文章发表在2002年PNAS上！
