为什么没有（四）？
（四）主要说的就是SAM格式，网上一搜就有，就没必要了
（五）就草草地记录了Chapter 4.1: RNA-Seq Applications - Chapter 5.2 Differential RNA-Seq
RNA-Seq的应用
生物体内的转录&翻译过程
RNA-Seq建库流程
1、提取所有的mRNA或所有的RNA
2、去除DNA（在RNA建库流程中，DNA被认为是污染物）
可选过程：去除rRNA（选择mRNA）
3、将RNA片段打断（二代测序读长问题）
4、将RNA逆转录为cDNA
可选过程：链特异性选择
5、连接adapter & PCR扩增
6、选择合适长度的cDNA
7、单端测序 或 双端测序
参考文献链接：
https://www.nature.com/articles/nrg3068
RNA-Seq的应用
RNA-Seq实验设计
注意事项：已经降解或部分降解的RNA不可用于建库
原因：当提取的RNA被作为archival tissue储存了很长时间，同时需要注意的是短片段RNA，其3'端更加稳定。
检查RNA质量的方式：DV200指标，指片段大于200 bp的RNA的占比。
【标注】推荐DV200 ＞ 30%
实验设计目的
RNA-Seq可以进行测序的几种RNA类型：
1、Ribo-minus：去除富集的rRNA和tRNA的RNA文库
2、使用PolyA-RNA（成熟的mRNA）进行建库
3、Strand specific/链特异性测序
【标注】一般用于挖掘novel LncRNA
测序价钱问题：一个sample 200$的情况
作为项目负责人，需要考虑的几个问题：
- SE or PE: PE getting more popular
- Depth: 20-50M for differential expression, deeper for transcript assembly or splicing.（20 million对于novel转录本和可变剪接的发现，并没有50 million的结果好）
- Read length: longer for transcript assembly, splicing, or mutation calls
4、评估biological variation
- technical replicates/技术重复：使用相同的RNA，对其测定多次；
【标注】MicroArray常用方法 - biological replicates/生物学重复：生物样本的重复
e.g. 同一株树，取3批叶片样本；患同一种癌症的人（群体）的细胞样品
【问】多少重复才足够？
RNA-Seq中的序列比对
由于在生成mRNA过程中，存在可变剪接，因此BWA等DNA序列比对软件不适用于RNA比对。
TopHat等RNA-Seq比对软件的算法，可简单概述为：
先构建参考序列的索引，将reads比对到参考基因组的exon上，同时使用不同的junction片段构建新的数据库，再将原始数据中不能比对到exon上的reads比对到junction上。
图示如下，以09年发表的TopHat作为例子：
比对生成的文件还是SAM/BAM格式，但是single-end和pair-end的数据存在一定差别：
- 第一列：read id
- 第二列：二进制标识符（如果是PE，则为奇数）
- 第三&四列：染色体编号 & 比对到染色体上的起始位置
- 第六列：cigar标识符，用于表示比对的具体情况
- 可选标识（e.g. XS，使用HISAT时可选，用于标识该序列来自正链 or 负链）
【例】
RNA-Seq：比对后的QC
RNA-Seq可能存在的问题：前几个碱基的测序质量不佳。解决方案就是使用Trimmomatic等软件将reads的前几个碱基剪切掉。
上述问题的原因，在这篇文献中有报道：https://academic.oup.com/nar/article/38/12/e131/2409775?login=true
RNA-Seq QC也可以用于查看数据的一些信息，比如插入片段长度、reads主要比对到什么区域、TIN（transcript integrity number）、medTIN（median transcript integrity number）等。如下：
可以在这个网站查看：http://rseqc.sourceforge.net/
看这部分的时候感觉有点懵啊，不是一般都先QC再比对吗？
RPKM, FPKM, TPM
RPKM，全称“Reads Per Kilobase Million”，用于single end RNA-Seq。
计算公式：
FPKM，全称“Fragments Per Kilobase Million”，用于paired-end RNA-Seq
计算公式：
TPM，全称“Transcripts Per Million”，现在最常用的RNA-Seq标准化方法。
我觉得看看这两篇文章差不多就ok了~
- 为什么都说RPKM和FPKM错了
- 浅谈RPKM, FPKM, RPM, TPM的区别
RSEM vs Salmon
（1）RSEM使用
输入数据：FASTQ or BAM
输出：转录本水平的表达量（e.g. read count, TPM, FPKM），该表达量计算结果基于转录组有效长度（effective transcript length），即exon的长度
【标注】effective length
计算公式：
为转录本长度，μ为插入片段平均长度
对于一条转录本，靠近5'端和3'端的部分较难被测序，因此若将此部分用于定量，会造成结果不准确。
同时，还需要考虑到的因素是一个gene可以有多个isoform，如下图：
【标注】isoform，为exon组合得到的mRNA
下图展示了3种不同的组织中，不同isoform的表达，同时根据reads count来估计每一种isoform在对应组织中的likelihood。
reads count表达量，如下表：
但是由于isoform3和isoform1和2，存在很多的重叠部分，因此上述分析对isoform3 likehood的估计是不准确的。
不通过比对也能够定量的方法 —— Pseudoalignment
RNA-Seq Read Distribution
（1）microarray
在芯片时代，RNA-Seq测序的reads分布，一般被认为是正态分布。
一般gene，在多个样品中的表达量分布，符合下图第三幅图：
（2）RNA-Seq
RNA-Seq测序得到的reads分布，一般符合泊松分布。
e.g. 泊松分布
RNA-Seq对应的表达量 —— 负二项分布
表达量越高的gene，其对应的表达量方差越大，反之亦然。
Differential Gene Expression
当获得的测序数据，不符合normal distribution（正态分布）时，可以对数据进行转换（e.g. log-transformation）
这边设计一个非常重要的概念，实际上就是针对什么类型（属于什么分布）的数据，使用什么检验方法
图示：
（1）microarray的标准化方式
算法：limma
【标注】一般使用t检验或t检验的变形对gene expression进行分析
limma的输入数据
（1）reads count matrix
（2）design matrix（sample属于何种实验条件）
（3）contrast matrix（对哪几种条件进行比较）
【分析标注】采用log-normal对原始数据进行转换，导致数据变泛了，对某些条件或某些gene的检测灵敏度不高了。
（2）基于负二项分布的标准化方法
负二项分布能够很好地捕捉到测序过程中的一些bias，对真实数据有一个更好的体现。
（3）DESeq2：Modeling overdispersion
RNA-Seq一般都只有2~3个rep，但是如果想要对真实的基因表达量的方差有一个体现，上述重复数肯定是不够的。
一般情况下，对基因表达量的mean和variance进行估计，估计出的方差是大于真实值的，如下图蓝线和黑线的区别：
差异表达基因的可视化
（1）火山图
（2）MA图
M：代表两种实验条件下的log ratio和log fold change
A：基因表达量的均值
后话
虽然跑过转录组，但是实际上我对其中的原理只能说是一知半解，还需要多实践。
课程得学，笔记也得做，实践也得跟上。
但是觉得笔记还是不够硬核，或许应该给自己看看就好。
