靶向CTLA-4或PD-1/PD-L1通路的单克隆抗体—免疫检查点抑制剂（CPI）治疗可在多种人类恶性肿瘤中诱导持久反应，但也会诱导炎症毒性，统称为免疫相关不良事件（irAEs）。然而，导致这些严重炎症副作用的免疫机制仍然知之甚少。
2020年8月6日，Dana-Farber癌症研究所和哈佛医学院Kai W.Wucherpfennig、Michael Dougan等共同合作在期刊Cell上发表了题为 Molecular Pathways of Colon Inflammation Induced by Cancer Immunotherapy 的文章。本研究通过对结肠炎（检查点抑制常见且严重的副作用）中免疫细胞群进行单细胞分析和T细胞受体（TCR）序列分析，揭示了治疗开始后结肠炎症状经常早期发作的原因，并确定了治疗结肠炎的潜在靶点。
01 +CPI结肠炎免疫细胞群的整体分析
研究人员对16名患者（n=6+CPI（检查点抑制剂诱发）结肠炎，n=5+CPI无结肠炎，n=5对照）进行scRNA-seq，通过CD45+进行富集后得到共51,652个细胞。数据整合后聚类得到16个不同的亚群，两个对照组（+CPI，无结肠炎和对照组）的T细胞群与结肠炎患者的T细胞群有显著差异，表明T细胞群的这些变化与疾病状态有关，而不是与药物暴露有关。与对照组相比，在结肠炎中CD8+细胞毒性淋巴细胞、循环T细胞以及髓系细胞显著增加，并通过流式分选进行了验证。这些结果表明，+CPI结肠炎与结肠免疫细胞的重大变化有关，包括细胞毒性、循环T细胞以及髓系细胞。
02 结肠炎相关CD8+T细胞毒性和增殖程序的变化
CD8+T细胞的聚类注释发现了8个亚群，亚群分布在+CPI结肠炎患者和两个对照组之间表现出显著差异：细胞毒性效应细胞和循环T细胞几乎完全属于+CPI结肠炎患者；与对照相比，在+CPI结肠炎患者中，代表组织驻留记忆T（Trm）细胞比例减少。该研究还通过流式细胞术证实了上述结果。
为了确定循环细胞毒性T细胞的定位，研究者对+CPI结肠炎与健康受试者的组织切片进行了多色免疫荧光分析：在接受CTLA-4和PD-1抗体治疗的+CPI结肠炎患者中，CD8+和CD4+细胞主要位于固有层（LP）中；在健康受试者的LP中观察到较少的CD8+和CD4+细胞。这些数据表明，结肠CD8+T细胞发生了显著的结肠炎相关变化，其特征是从Trm转变为细胞毒性和循环效应T细胞。
03 +CPI结肠炎中CD4+效应和调节性T细胞的增加
CD4+T细胞的亚聚类显示，10个亚群在+CPI结肠炎和对照病例之间表现出显著差异：Th1效应细胞、循环和调节性T细胞（Treg）几乎完全由来自+CPI结肠炎患者的细胞组成。与CD8+T细胞群类似，Trm细胞比例在结肠炎患者中减少。流式细胞术分析显示，与两个对照组相比，+CPI结肠炎患者CD4+T细胞群中FoxP3+细胞的百分比显著升高，这与Treg细胞增殖增加一致。与健康对照受试者相比，+CPI结肠炎患者的Treg细胞中的FoxP3蛋白水平更高。高水平FoxP3是真正Treg细胞的特征。与两个对照组相比，+CPI结肠炎患者的CD4+T细胞中CTLA4 mRNA和CTLA-4蛋白水平也保持不变。这些数据表明，CPI或抗CTLA-4单药联合治疗诱导的结肠炎不是由CTLA-4+Treg细胞耗竭引起的，并且炎症环境改变了Treg细胞的基因表达程序。
04 结肠炎相关T细胞和Trm CD8+T细胞群之间的共享TCRs
对于每位患者，研究人员确定了由两个或多个集群共享的扩增TCR克隆型的数量，以评估与疾病相关的TCR共享克隆型。在+CPI结肠炎患者中，循环细胞中94.2%的扩增TCRs与细胞毒性效应细胞共享，揭示了这两种结肠炎相关CD8+T细胞状态之间的动态联系。在结肠炎患者中，来自Trm T细胞的很大一部分克隆扩增的TCRs与结肠炎相关的循环细胞和细胞毒性效应细胞共享。而在对照组中，扩增的TCR克隆型主要在Trm亚群1和2之间共享，RNA速率分析揭示了从Trm到细胞毒性效应细胞的潜在分化轨迹。这些数据表明，在+CPI结肠炎患者中，结肠炎相关的CD8 T细胞群与Trm CD8 T细胞群之间存在动态联系。
05 结肠炎相关T细胞群的基因表达程序
研究人员评估了结肠炎相关CD8+和CD4+T细胞群对抑制性受体的表达。CTLA4基因表达在结肠炎相关的CD8+和CD4+T细胞亚群中显著上调，PDCD1（编码PD-1）的表达在结肠炎相关的CD8+和CD4+亚群中升高。为了确定常见的分子通路和潜在的干预靶点，研究人员评估了结肠炎相关亚群中差异表达最多的基因，发现细胞毒性基因GZMB和GNLY（CD8+T细胞）和GZMA（CD4+T细胞）是结肠炎相关亚群中差异表达最高的基因。许多结肠炎相关上调基因是IFNγ响应的特征，与结肠炎相关CD8+和CD4+T细胞亚群中IFNG mRNA的升高一致。已有研究表明IFNγ可直接诱导结肠上皮细胞凋亡，并通过MHC I类和II类途径增强抗原向T细胞呈递。
06 髓系细胞中炎症基因表达特征
与所有其他免疫细胞群相比，IFNγ和TNFα诱导的信号特征在髓系细胞中显著上调。与对照组患者相比，+CPI结肠炎的髓系细胞中差异表达最多的基因是IFNγ响应基因，包括CXCL9和CXCL10，它们编码的趋化因子将CXCR3效应T细胞募集到炎症部位。通路富集分析还显示，与对照组患者相比，+CPI结肠炎患者的髓系细胞上调了与IFNγ响应和TNFα信号转导相关的基因集。髓系细胞的亚聚类显示亚群1中的大多数巨噬细胞起源于+CPI结肠炎患者，并表现出IFNγ诱导基因的表达升高，也具有升高的TNFα信号基因表达特征。这些数据表明，IFNγ改变了髓系细胞的基因表达程序，并诱导趋化因子的表达，这些趋化因子可以将效应T细胞募集到炎症部位。
07 T细胞-髓系细胞连接产生的潜在治疗靶点
与对照组相比，+CPI结肠炎患者的T细胞中的趋化因子受体基因CXCR3和CXCR6上调。先前研究已发现CXCR6在多种人类癌症中过表达，并在转移中起重要作用。因此，CXCR6抑制可以减少癌细胞转移并改善结肠炎症，尽管这种趋化因子受体在肿瘤免疫中的作用仍有待进一步研究。在+CPI结肠炎患者中，T细胞过表达CXCR3基因，髓系细胞过表达CXCL9和CXCL10，表明这种T细胞-髓系相互作用对T细胞募集也很重要。另外通过分析还发现抑制αEβ7和α4β7整合素功能的β7链特异性单克隆抗体，TNFα及IL-1b的抑制性抗体也可能是+CPI结肠炎的治疗靶点。
结论和意义
这项对+CPI结肠炎的综合单细胞分析确定了这种常见且严重的irAE背后的免疫细胞组成和效应程序的重大变化。TCRαβ分析表明CD8 Trm细胞与+CPI结肠炎患者细胞毒性效应细胞的出现之间存在关联。结肠炎可能是一种相对常见的早期 irAE，因为健康结肠中已经存在大量此类组织驻留的CD8+ T细胞。因此，组织驻留CD8+ T细胞的激活在结肠炎中可能起重要作用，并且此类T细胞的激活随后诱导从血液中募集额外的CD8+和CD4+T细胞群。本文还筛选出了irAEs潜在的治疗靶点，它们为结肠炎和检查点阻断引发的其他irAEs提供了丰富的靶点治疗的来源，具有较高的临床价值。
参考文献：
Luoma AM, Suo S, Williams HL, Sharova T, Sullivan K, Manos M, Bowling P, Hodi FS, Rahma O, Sullivan RJ, Boland GM, Nowak JA, Dougan SK, Dougan M, Yuan GC, Wucherpfennig KW. Molecular Pathways of Colon Inflammation Induced by Cancer Immunotherapy. Cell. 2020 Aug 6;182(3):655-671.e22. doi: 10.1016/j.cell.2020.06.001. Epub 2020 Jun 29. PMID: 32603654; PMCID: PMC7415717.
