Mol Cell | 紧凑型CRISPR技术更易于传递至细胞，治疗潜力巨大

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由斯坦福大学的一个团队领导的科学家开发了一种紧凑、高效的CRISPR-Cas系统，称为CasMINI，其大小约为现有CRISPR-Cas系统的一半，可广泛用于基因治疗应用和细胞工程。研究人员在实验中证实，CasMINI可以像其较大的同类产品一样，删除、激活和编辑目标基因序列。但CasMINI相对较小的尺寸意味着它更容易进入人体细胞和人体，使其成为治疗多种疾病的潜在工具，包括眼病、器官退化和遗传疾病。

通常使用的CRISPR系统，例如基于Cas9和Cas12a CRISPR相关蛋白（Cas）的系统，由大约1000到1500个氨基酸组成，而新的CasMINI系统只有529个氨基酸。

“这是CRISPR基因组工程应用向前迈出的关键一步。”资深研究作者、斯坦福大学医学院化学与系统生物学助理教授、斯坦福大学ChEM-H研究所学者Stanley Qi博士说，“据我们所知，这项工作展示了迄今为止最小的CRISPR，作为一种基因组编辑技术。如果人们有时认为Cas9是一把分子剪刀，那么我们在这里创造了一把包含多种功能的瑞士刀。它不是一个大的，而是一个小型的，便于携带和使用。”

这项研究发表在《Molecular Cell》上的一篇题为“Engineered miniature CRISPR-Cas system for mammalian genome regulation and editing”的论文中。

作者写道，用于人类细胞的CRISPR-Cas系统的开发已经“彻底改变了基因组工程”。但是，尽管这些系统为各种遗传疾病的基因疗法的发展提供了机会，但它们的大尺寸往往限制了向细胞的传递，从而限制了它们潜在的临床应用。例如，广泛应用于体内递送的腺相关病毒（AAV）载体的有效载荷包装容量限制小于4.7kb，而许多Cas融合蛋白超出了这个范围。研究人员表示：“CRISPR-Cas 效应子及其融合蛋白的大尺寸对有效的细胞工程和体内递送提出了挑战。我们迫切需要设计高效、紧凑的Cas系统，以促进下一代基因组工程应用。”

一种可能的解决方案是Cas12f，也称为Cas14，它的大小不到当前使用的CRISPR系统（如Cas9或Cas12a）的一半。但直到现在，还不清楚这种紧凑型蛋白质是否可以用于哺乳动物细胞。“近年来已经鉴定出数千种CRISPR，它们被称为细菌的免疫防御系统。然而，超过99.9%的已发现CRISPR无法在人类细胞中发挥作用，这限制了它们作为基因组编辑技术的使用。”研究人员解释说。

在他们新报告的工作中，Qi及其同事将 RNA 和蛋白质工程应用于Cas12f系统，以生成一个高效的哺乳动物基因组工程微型Cas系统。通过优化单向导RNA设计并进行多轮迭代蛋白质工程和筛选，研究人员生成了一类名为CasMINI的Cas12f变体。

研究人员决定从CRISPR蛋白Cas12f开始，因为它只包含大约400到700个氨基酸。科学家们指出：“工程化CasMINI分子的大小为529个氨基酸，分别比常用的SpCas9（1368个氨基酸）和LbCas12a（1228个氨基酸）小62%和57%。”然而，与其他CRISPR蛋白一样，Cas12f天然起源于古细菌——单细胞生物——这意味着它不太适合哺乳动物细胞，更不用说人类细胞或身体了。已知只有少数CRISPR蛋白无需修饰即可在哺乳动物细胞中发挥作用。不幸的是，CAS12f不是其中之一。这对生物工程师们来说是一个诱人的挑战。“我们想，好吧，数百万年的进化并没有能够将这个CRISPR系统转变成在人体内发挥作用的东西。我们能在一两年内改变这种状况吗？”研究人员说，“据我所知，我们第一次将无效的CRISPR变成了有效的CRISPR。”

Xiaoshu Xu是Qi实验室的博士后学者，也是这项新报告研究的主要作者，她在人体细胞中未发现天然Cas12f的活性。Xu和Qi假设问题在于人类基因组DNA比微生物DNA更复杂，且更难获得，这使得Cas12f很难在细胞中找到目标。通过观察Cas12f系统的计算预测结构，她仔细选择了蛋白质中大约40个可能绕过这一限制的突变，并建立了一条一次测试许多蛋白质变体的管道。理论上，一种有效的变体可以通过激活其基因组中的绿色荧光蛋白 (GFP) 将人类细胞变成绿色。

“起初，这个系统在一年内根本不起作用。”研究人员说，“但经过生物工程的反复试验，我们看到一些工程蛋白质开始像魔法一样启动。这让我们真正体会到合成生物学和生物工程的威力。”

虽然第一次成功的结果只是适度的，但团队受到了鼓舞，因为即使是适度的结果也意味着系统有效。经过多次迭代，研究人员能够进一步提高蛋白质的性能。“我们一开始只看到两个细胞显示绿色信号，现在经过改造，在显微镜下几乎每个细胞都是绿色的。”研究人员说。但通过优化单导向RNA设计和进行多轮迭代蛋白质工程和筛选，研究人员生成了一类名为CasMINI的Cas12f变体。

除了他们的蛋白质工程工作外，研究人员还设计了将Cas蛋白引导至其目标DNA的RNA。对这两种成分的修饰对于使CasMINI系统在人类细胞中发挥作用至关重要。令人鼓舞的是，工程化Cas12f蛋白变体与工程化单导向RNA相结合，显示出有效的基因调控和基因编辑活性。“通过优化单导向RNA（sgRNA）设计并进行多轮迭代蛋白质工程和筛选，我们产生了一类Cas12f变体（即CasMINI），当与转录激活剂融合时，可以有效激活报告基因和内源性基因表达。”作者报告说。他们测试了CasMINI在实验室人类细胞中删除和编辑基因的能力，包括与HIV感染、抗肿瘤免疫反应和贫血相关的基因。它对他们测试的几乎所有基因都起作用，对几个基因产生了强烈的反应。

测试表明，CasMINI可以驱动高水平的基因激活，与Cas12a相关的基因激活水平相当，并允许进行稳健的碱基编辑和基因编辑。此外，该系统被发现具有高度特异性，并且不会产生可检测的脱靶效应。作者指出：“这种dCasMINI介导的基因激活比野生型dCas12f系统有显著的改善，具有与dCas12a系统相当的激活能力，并且在哺乳动物细胞中具有特异性，而没有可检测到的脱靶。”作者指出，“CasMINI为广泛的基因组工程应用提供了一个有用的工具，这些应用需要紧凑的Cas融合蛋白来传递和发挥细胞功能。”

“在这里，我们通过合理的RNA工程和蛋白质工程，将哺乳动物细胞中不工作的CRISPR转化为高效工作的CRISPR。”研究人员说，“此前，其他人曾努力提高工作CRISPR的性能。但我们的工作是第一次使非工作CRISPR发挥作用。这凸显了生物工程在实现进化尚未实现的目标方面的力量。”

工程化CasMINI分子的大小仅为529个氨基酸。这种小尺寸使其适用于广泛的治疗应用。CasMINI融合蛋白也非常适合AAV包装。“我们分析了CasMINI与广泛使用的阻遏因子、激活因子和基因编辑域的融合，并观察到它们都低于AAV包装限制（<4.7 kb）。”研究人员说。此外，CasMINI mRNA可以很容易地包装到脂质纳米颗粒或其他RNA递送方式中，从而有可能增强其进入细胞的能力。“我们还假设，与大蛋白有效载荷相比，它的小尺寸和非人类病原体来源使其可能具有较低的免疫原性。”研究小组补充道，“我们设想在本研究中开发的这些合成的、紧凑的Cas效应器将广泛用于基因治疗和细胞工程应用。”

需要做更多的工作来进一步优化CasMINI在碱基编辑和基因编辑方面的效率，并用不同的递送方式在体内测试系统的性能。研究人员计划对该系统进行体内基因治疗应用测试。“微型CasMINI的可用性实现了新的应用，从体外应用，如设计更好的肿瘤杀伤淋巴细胞或重编程干细胞，到治疗眼睛、肌肉或肝脏遗传疾病的体内基因治疗。”研究人员指出，“在我们的愿望清单上，它将成为一种治疗遗传疾病、治愈癌症和逆转器官退化的疗法。”

研究人员已经开始建立合作，以寻求基因疗法。他们还对如何促进RNA技术的进步感兴趣，例如用于开发mRNA COVID-19疫苗的RNA技术，其中大小也可能是一个限制因素。

“自CRISPR早期以来，这种设计这些系统的能力就一直是该领域所渴望的，我觉得我们为实现这一目标尽了自己的一份力量。”研究人员说，“而且这种工程方法可以提供如此广泛的帮助。这就是让我兴奋的地方——为新的可能性打开大门。”

作者指出，虽然先前的研究已经使用蛋白质工程技术来产生增强的Cas12a或Cas12b变体，但新的研究表明，可以从在哺乳动物细胞中没有可检测活性的初始系统开始设计有效的Cas12f效应器。“这项工作中使用的RNA和蛋白质工程方法可能适用于设计更多来自其他细菌或古细菌物种的Cas12f/Cas14效应子。”他们说，“这些结果可能表明Cas12家族中的许多系统可以通过蛋白质和引导RNA工程进行优化，以获得更好的效率。”