十五、结核病原（分枝杆菌、抗酸染色+、卡介苗、结核菌素“OT、PPD”试验--迟发超敏反应）
结核杆菌：分枝杆菌属内-主要致病菌（结核分枝杆菌、牛分枝杆菌）
直or稍弯曲细长杆菌，呈V、Y形or条索状、短链状排列，抗酸染色阳性
生长很缓慢！培养8d↑~8weeks
专性需氧（菌膜生长）、营养要求较高。抵抗力较强
慢性感染、引起肉芽肿
诊断依据：
- 临床表现
- X线检查
- 结核菌痰涂片
- 结核菌素试验
涂片阳性--病人是重要传染源
结核感染or接种卡介苗（减毒活疫苗）→产生特异性免疫（感染免疫、又称有菌免疫）
机体抵抗依赖“细胞免疫”，伴随“迟发超敏反应”→结核菌素试验：用结核菌素测定能否引起皮肤迟发超敏反应。
（结核菌素）简称“结素”，是通称：旧结核菌素OT、结核菌素纯蛋白衍生物PPD。
用于接种质量考核、筛选预防对象、感染率调查、辅助诊断。
试验方法：前臂掌侧中央、0.1 ml 结核菌素溶液、5~6 mm皮丘、72 h检查、50 IU/ml制剂硬结直径5 mm↑为+
- 阴性(-)意义：①未受结核菌感染②已感染但处变态反应前期③免疫系统受干扰④结核性脑膜炎和粟粒性肺结核等使“免疫功能低下”。
- 阳性(+)意义：①结核病患者②结核菌感染但未患病③卡介苗接种④非结核分枝杆菌感染交叉反应
十六、麻风病原（分枝杆菌、胞浆泡沫状--麻风细胞、抗酸染色--改良Fite染色法）
麻风分枝杆菌：多形性、抗酸性、聚簇性。
典型胞内菌、麻风细胞：胞浆泡沫状
体外培养失败
诊断应及时&慎重。皮肤切刮法涂片查菌、组织病理学检查
涂片染色显微镜检查：鼻黏膜or皮损处取材、抗酸染色（改良的Fite染色法）
十七、空肠弯曲菌CJ、GBS相关、人畜共患、G-
CJ夏秋季高发、旅行者腹泻主要病因之一
学龄前儿童发病高，与吉兰-巴雷综合征GBS密切相关，人畜共患病。
- 标本采集
粪便、肛拭，保存于运送培养基中，4 h内送检or保存液-20℃↓ - 分离培养
采样棉拭子→空弯选择性血平皿→42℃微需氧（85%N2、10%CO2、5%O2、烛缸法）2~3 d。
可疑菌落：不溶血、灰色、扁平、湿润、有光泽、像水滴、12mm、边缘完整发亮）阴性继续710 d - 病原鉴定
氧化酶&过氧化氢试验+→革兰染色：G-、S形、螺旋形、纺锤形→初步确定
以下试验5%微需氧培养 - 42℃&25℃生长试验：接种2管布氏杆菌肉汤、42/25℃--48 h、
（42℃生长、25℃不长） - H2S产生试验。空弯、结肠弯曲菌+；胎儿弯曲菌-
- 马尿酸盐水解试验：空弯+、结肠弯曲菌-。
- 深入鉴定
PCR证实
十八、幽门螺杆菌HP（大量高活性尿素酶、cagA基因阳性）
螺杆菌属（从弯曲菌分出来）。急慢性胃炎、消化性溃疡最主要病因；胃癌、胃淋巴瘤 密切相关。
- 标本采集
胃镜、胃黏膜活检组织、保存液（100g/L蔗糖、500ml/L小牛血清）08℃12 d；-20℃1~2 m；-80℃ 1 y。冷冻后不可冻融，干冰转运。 - 镜检
涂片or病理组织S-W银染色，敏感性&特异性低。 - 病原分离
布氏培基or脑心浸液血琼脂+5%10%羊血&马血、85%N2、10%CO2、5%O2（orH2）、37℃37 d→针尖状or 1 mm↓半透明菌落 - 病原鉴定
HP重要特性：大量高活性尿素酶。触酶&氧化酶+、快速分解尿素、碱性磷酸酶&γ-谷氨酰转肽酶活性、硝酸盐还原实验阴性。三糖铁琼脂不产H2S。 - 深入鉴定
cagPAI右侧末端DNA--分为 Ⅰ~Ⅴ型
我国均为cagA基因阳性 - 快速检测
尿素呼吸试验--简单快捷，敏感度高。C13非同位素、可用于儿童孕妇。贵！ - 抗体检测 HP IgG变换慢，多用于流调
十九、军团菌（G-杆菌、无荚膜、水解马尿酸、BCYE-α培养基:焦磷酸铁&L-半胱氨酸→GVPC(-Cys)选择性培养基、尿标本中Lp抗原）
嗜肺军团菌：G-杆菌、无荚膜、无芽孢。不产酸、有鞭毛（镀银染色法）、能动。
不易着色、吉姆尼茨染色法or镀银染色
分离时需要"L-半胱氨酸，铁盐"促生长。
水解马尿酸盐--特征
- 采取标本
血液、痰（60℃加热2mins）、尿液
环境污染调查：应取水样--空调冷却水、1L、玻璃、聚乙烯瓶子、使用前洗净&121℃高压20mins。
水样中生物杀灭剂？容器中+过量灭活剂，6~18℃避光隔热运送、浓缩培养时间＜14 d。 - 病原分离
10^5/L可直接接种、否则先浓缩。过滤、离心→滤出物、沉积物少量水中悬浮。
样品→3份：none、酸处理（+等量酸缓冲液摇匀、静置5±0.5 mins）、热处理（50±1℃水中30±2 mins）
BCYE-α培养基:焦磷酸铁&L-半胱氨酸
GVPC培养基（选择性）在BCYE-α加入甘氨酸、多粘菌素B、万古霉素、放线菌酮。
3种标本→3个GVPC平板→平板倒置、潮湿、36±1℃、2~5%CO2
10 d后计数、3平板上各种不同菌落每种2~3个在BCYE & BCYE-Cys（no半胱氨酸）传代，BCYE生长&BCYE-Cys不长 即认为军团菌 - 病原鉴定：免疫荧光方法证实
- 尿抗原检测：急性期、恢复期尿标本中Lp抗原。
- 抗体检测应用：IFA检测血清中抗体，滴度4倍↑or单份≥1:256
二十、流感嗜血杆菌(G-球杆菌、有荚膜！含V、X因子才生长、卫星现象）
寄生于鼻咽部、冬季多。3个月~3岁婴幼儿易感、引起脑膜炎占2/3(神经后遗症)、小儿肺炎(第2位病原菌)等等各种炎症。呼吸道传播。本菌抵抗力弱、100℃立即死亡、干燥痰48 h。
- 采集标本
脑脊液、血液、胸水中检出→临床意义；耳鼻咽拭子、痰→流行意义 - 镜检：G-球杆菌
- 病原分离
巧克力血琼脂、37℃、pH 7.6、5%CO2、含V&X因子培养基（由血红蛋白提供的X因子（factors X；血晶素 hemin）和由复合维生素提供的V因子（NAD））才生长
<u>血平板上不溶血</u>。
生长在血培养基上金葡菌周围--卫星现象 - 病原鉴定
裂解马红细胞能力→从溶血性嗜血杆菌中区分流感嗜血杆菌、从副溶血嗜血杆菌中区分副流感嗜血杆菌。
吲哚试验、尿素反应、鸟氨酸代谢→流感嗜血杆菌分为8个生物型，大部分ⅠⅡⅢ型(Ⅰ、Ⅲ型为主)
有荚膜的为可分型、不可分型（无血清型、来自鼻咽部）
依据荚膜多糖抗原不同→<u>a~f 血清型</u>；b型流感嗜血杆菌引起绝大多数侵袭性嗜血杆菌感染 - 深入鉴定
具荚膜菌株都包含“荚膜多糖基因”cap基因簇、ⅠⅡⅢ部分组成、Ⅱ区为合成血清型特异性基因。依据cap序列设计引物，鉴别流感嗜血杆菌。
有6种主要外膜蛋白OMP1-6，重要的毒力因子。外膜蛋白电泳图谱→菌株分类 - 抗体检测
保护性最低抗体水平0.05~0.15μg/ml；发病早期＞0.15μg/ml具有“否定”诊断意义，抗体4倍↑--支持诊断
二十一、克雷伯杆菌（肺炎杆菌、G-较粗短杆菌、有较厚荚膜、多数有菌毛、K抗原-荚膜肿胀实验）砖红色、胶冻样痰液
肺炎杆菌、G-杆菌、有较厚荚膜、呼吸道肠道定殖菌、条件致病菌。老年、营养不良、慢性酒精中毒、慢性支气管-肺、全身衰竭。占细菌性肺炎2%、病死率30%。
- 采集标本
主要：痰液-来自下呼吸道合格标本、也可其他 - 病原分离
痰→盐水洗涤3次→1%胰酶溶液、37℃水中90 mins：均质化
血琼脂培养基、麦康凯，37℃、24 h→血琼脂上菌落大、黏液型、光亮、黏稠、可拉丝。 - 病原鉴定
选择性培养基上--发酵乳糖
<u>O抗原、K抗原</u>--用以分型（荚膜肿胀实验）3、12型
magA基因--高黏性表型、用作诊断。rmpA基因--辅助诊断
二十二、衣原体-细胞内寄生、还有立克次体（G-、通过细胞滤器、McCoy细胞、免疫荧光-包涵体\吉姆萨(暗视野显微镜观察)比碘染敏感）
非运动性细菌、有细胞壁、G-、广泛寄生动物细胞内、仅少数致病性
无合成ATP、GTP能力、能量寄生物、能通过*细胞滤器、严格细胞内寄生、原核细胞型
周期2个阶段：原生小体elementary body感染阶段-感染力；网状小体initial body繁殖阶段-增殖力
1采取标本
眼部、生殖道→拭子→悬浮在抗生素肉汤/细胞培养基→混合、离心10 mins→去上清→抗生素溶液稀释1:2 & 1:20
淋巴脓肿黏性→研磨、悬浮在细胞培养液；血凝块→悬液；痰、咽喉洗液→含抗生素肉汤。
含冰块运输培养液--2sP、加不同浓度胎牛血清:增加发现率、维持感染性。-60℃保存、4℃融化、研磨乳悬液、稀释后接种抗生素培养基
2病原分离
环乙酰亚胺处理的McCoy细胞→48~72 h→染色、免疫荧光的单克隆抗体方法--检测衣原体的包涵体
3病原鉴定
免疫荧光、碘染色、吉姆萨染色→检测盖玻片上的包涵体；吉姆萨(暗视野显微镜观察)比碘染敏感
二十三、支原体（G-、油煎蛋样菌落、缺乏细胞壁、最小独立微生物、通过除菌滤器、人型支原体pH 6.6、解脲支原体pH 6.0、酶联吸附捕获法P1蛋白-肺炎支原体）
缺乏细胞壁、原核细胞型、已知独立生活最小微生物！通过除菌滤器。
16种、5种致病：肺炎支原体、（解脲、人型、生殖、发酵）支原体--泌尿生殖道感染
1采集标本
黏膜组织→拭子涂抹取样、分泌液→支原体液体培养基小管
组织块→研磨成乳浆状接种
2病原分离
需要丰富“胆固醇、血清蛋白、酵母浸液”。5%CO2、95%N2、36~37℃。
加入0.002%酚红指示剂、可加醋酸铊及抗生素等抑菌剂
人型支原体pH 6.6、解脲支原体pH 6.0、其他7.6~8.0
*油煎蛋样菌落--太小、低倍镜看
G-但不易着色、吉姆萨：淡紫色、Dienes染色：蓝色不易褪色--可鉴别
3病原鉴定
表格：支原体与细菌病毒等特征
能通过450nm滤膜？
4快速检测
双抗体夹心ELISA法测支原体“外膜蛋白”&免疫印迹测支原体“抗原”
酶联免疫吸附试验捕获法：肺炎支原体，170kDa膜蛋白（P1抗原）的单抗测呼吸道“P1蛋白”,3 h,敏感性10^4 CFU/ml[一万菌落形成单位]
核酸杂交技术、PCR--各种基因
5抗体检测：4倍↑--诊断意义
