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编者按：
microRNA是一种长度为22~25nt的内源性非编码RNA，其在蛋白编码基因转录后水平发挥重要的负调节作用。是近20年来科学界研究热点。根据其在肿瘤发生发展中作用，miRNA大致可分为促癌性miRNA与抑癌性miRNA。
胆囊，是一个位于右肋下肝脏后方的梨形囊袋状器官，颈部连胆囊管，胆囊管向上连接肝总管，向下连接胆总管（解剖结构见下图）；胆囊具有储存和浓缩胆汁的功能，常见的胆囊相关疾病包括胆结石、胆囊炎、胆囊息肉及胆囊癌等。胆囊癌（GBC）是最常见的胆道恶性肿瘤，也是第七大最常见的胃肠道癌症。流行病学调查显示，GBC的发生率为2.5/10^5人。尽管发病率相对较低，但与GBC相关的死亡率仍高于其他癌症。且就诊时患者往往处于晚期，失去手术机会，晚期胆囊癌的预后很差，5年生存率仅为5％。因此，寻找一种新的治疗方法对中晚期胆囊癌来说是至关重要的，这其中就包括miRNA在胆囊癌中的基础研究。
今天给大家带来的是上海交通大学医学院附属新华医院刘颖斌教授团队2017年在nature子刊Cell Death and Differentiation杂志上发表的MicroRNA-29c-5psuppresses gallbladder carcinoma progression by directly targeting CPEB4 andinhibiting the MAPK pathway 研究论文。
文章从运用miRNA芯片分析胆囊癌组织与癌旁组织（NAT）各miRNA表达差异开始，鉴定出miRNA-29c-5p在胆囊癌组织中表达明显下调，然后临床分析了其与胆囊癌患者预后及临床病例特征存在关联，进而在体内外实验中证明miR-29c-5p在胆囊癌细胞增殖中起重要作用，且通过减少上皮间质转化抑制胆囊癌细胞转移与侵袭，最后得出MicroRNA-29c-5p通过直接靶向CPEB4和抑制MAPK途径来抑制胆囊癌的进展的结论。
Results解读：
作者首先运用miRNA芯片分析比较GBC组织和NAT的miRNA表达谱。结果显示13种miRNA的水平发生了显着变化（“> 2倍”），其中包括11个下调的miRNA和2个上调的miRNA（图1a）。与NAT相比，GBC组织中miR-29c的表达最显着下调，表明miR-29c是肿瘤发生的关键介质。作者通过qRT-PCR检测40对GBC组织及其相应的NAT的miR-29C-3P和-5p的表达水平。和miRNA芯片数据一致，与NAT相比，肿瘤组织中的miR-29c-5p表达显着下调（P = 0.018；图1b）。然而，miR-29c-3p的表达没有显着下降（P = 0.774; 图1c），因此作者在随后的研究中重点关注miR-29c-5p。与非转移性GBC患者相比，发生转移的GBC患者具有更低的miR-29c-5p表达水平（P <0.001；图1d），可能暗示了miR-29c-5p参与GBC的转移。
因为miR-29c-5p表达水平与淋巴结转移相关，所以作者进一步研究了miR-29c-5p表达对预测GBC转移的诊断潜力。发现miR-29c-5p表达水平的ROC曲线（AUC）下面积为0.855（95％CI：0.733-0.977；图1e）。miR-29c-5p表达水平的最佳临界值（2- ΔCT= 0.032）是基于ROC曲线分析选择的; 因此，GBC组织中的miR-29c-5p表达水平被分为低表达组或高表达组。使用这些标准，分析了miR-29c-5p表达水平与GBC的临床病理特征和预后之间的相关性。在具有淋巴结转移的GBC组织中，miR-29c-5p表达水平显着降低（P <0.001；表1（未列））。
更有趣的是，生存分析表明，与miR-29c-5p低表达的患者相比，miR-29c-5p高表达的GBC患者的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）更好（1-和3年OS：55.7％和33.4％，而 32.0和16.0％，P = 0.040；1年和3年DFS：85.1和60.8％，而 35.9和12.0％，P = 0.002；图1f和g）
为了检测miR-29c在GBC发生中的生物学功能，作者测定了miR-29c-3p和-5p在5种GBC细胞系和正常胆管上皮细胞系中的表达水平（图2a）。与肿瘤组织特征一致，GBC细胞表达的miR-29c-5p水平低于miR-29c-3p。随后作者将miR-29c前体（pre-miR-29c）及其特异性抑制剂anti-miR-29c-5p引入了GBC-SD和NOZ细胞系。通过实时PCR证实了miR-29c-5p的不同表达水平（图2b）
进一步作者采用CCK8与克隆形成实验评估miR-29c-5p在GBC细胞增殖中的作用。结果表明，与pre-miR-NC细胞相比，pre-miR-29c细胞的增殖明显减少，而与抗NC相比，anti-miR-29c-5p细胞的增殖明显增加（图2c和d），与该miRNA在GBC细胞增殖中的抑制作用一致。
随后作者发现过表达miR-29c-5p后活化的Chk1和Chk2，即p-Chk1（S-345）和p-Chk2（T68），表达增加（图2e和补充图S2B）。据此推测miR-29c-5p通过激活Chk1/2并随后引起G1期阻滞促进自发性DNA损伤修复，从而阻止了肿瘤的进展。接着作者做了体内实验，用miR-29c-5pagomir治疗2周后，肿瘤生长明显被抑制（图2f）。此外，免疫组化显示miR-29c-5pagomir接种的肿瘤组织中E-cadherin表达增加，波形蛋白表达降低，Ki-67阳性细胞数量减少以及缺乏磷酸化的MEK（图2h）。
伤口愈合试验表明，GBC细胞中miR-29c-5p表达的增加与伤口闭合明显减慢有关，而GBC细胞中miR-29c-5p表达的降低导致伤口闭合明显增快（P <0.05；图3b）。Transwell实验表明，pre-miR-29c细胞的侵袭性低于pre-miR-NC细胞，而抗miR-29c-5p细胞的侵袭性高于抗NC细胞（P <0.001；图3a和补充图S1C）。相应的，蛋白印迹实验和免疫荧光（ICC）分析表明，miR-29c-5p的表达显着增加了EMT相关基因E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的表达，并降低了波形蛋白的表达（图3c和d及补充图S1E–F）。
为了在体内证实这些发现，作者通过尾静脉注射进行了肺肿瘤转移测定，以监测裸鼠中NOZ细胞的转移能力。如图3e所示，对照组的肺部转移率和转移结节的数量显着要高于经miR-29c-5p agomir治疗的小鼠。这些结果在体内外实验表明了miR-29C-5P通过减少上皮间质转化（EMT）抑制GBC细胞的转移和侵袭。
为了探究miR-29c-5p抑制GBC细胞增殖和转移的分子机制，作者首先研究了miR-29c-5p对凋亡的影响。miR-29c-5p细胞和对照细胞的凋亡指数分别为38.76和25％（相对于GBC-SD细胞，P <0.001），分别为24.3和4％（对于NOZ细胞，P <0.001；对于NOZ细胞，P <0.001）（图4a）。此外，抗miR-29c-5p细胞的凋亡指数低于阴性对照细胞（图4a）。如图4b，用pre-miR-29c处理的细胞显示绿色荧光增加，表明线粒体功能丧失。这些结果表明，miR-29c-5p通过线粒体依赖性机制诱导凋亡。
通过分析与miR-29c-5p相关的差异表达基因，作者推测MAPK / ERK信号通路是miR-29c-5p抑制GBC肿瘤发生和转移的主要途径（图4c）。随后作者对参与MAPK信号通路的蛋白质的磷酸化状态进行了蛋白印迹分析。与对照组细胞相比，miR-29c-5p过表达的细胞MEK1/2，p44/42 MAPK和Akt在Ser473处磷酸化水平降低，而总蛋白水平则不受miR-29c-5p表达的影响。灭活的Akt随后调节Bcl-2家族蛋白。结果，相对于对照细胞，在miR-29c-5p过表达的细胞中，caspase-9，caspase-3和PARP的后续切割均增加。当miR-29c-5p在GBC细胞中被抑制时，MEK1 / 2，ERK和Akt的磷酸化被逆转（图4d和补充图S2A）。此外，当使用MEK1 / 2抑制剂时，miR-29C-5P阻断MEK1 / 2和ERK的磷酸化的效果几乎完全消失（图4e和补充图S2C）。这些结果表明，MAPK / ERK途径可能参与了miR-29c-5p诱导的GBC细胞凋亡。
（a）由两个计算预测程序预测的潜在miR-29c-5p目标。列出的它们之间的重叠（右）。（b）如材料和方法中所述构建荧光素酶报道质粒。显示了CPEB4的3'UTR内的预测的miR-29c-5p结合位点的序列，包括野生型和突变体结合位点。将上述报告质粒或模拟报告质粒共转染到感染了pre-miR-29c的293 T细胞中后，分析了相对荧光素酶活性（*** P <0.001）。Pre-miR-29c而非pre-miR-NC特异性地降低了CPEB4 -3' -UTR-WT荧光素酶报道基因的表达。相反，在用CPEB4--3' -UTR-Mut报道基因转染的细胞中未观察到相对荧光素酶表达的变化（c）用抗miR-29c-5p，抗NC，pre-miR-NC或pre-miR-29c感染的GBC-SD和NOZ细胞中CPEB4蛋白的蛋白质印迹分析。总的来说，这些结果表明CPEB4是miR-29c-5p的直接靶标，并且可以被miR-29c-5p负调节。
我们的qRT-PCR分析显示，与NAT相比，GBC组织中CPEB4的表达显着上调（图5d），使用Pearson相关分析，我们计算了肿瘤样品中miR-29c-5p与CPEB4 mRNA水平之间的显着负相关（R = -0.571，P <0.001；图5e和f），使用线性回归分析和配对t检验，对图5d中使用的相同样品，确定了miR-29c-5p和CPEB4表达水平之间的相关性。（g）有代表性的IHC显微照片，显示在具有高或低miR-29c-5p表达的GBC组织中CPEB4蛋白的表达。（i）使用Kaplan-Meier分析比较了高和低miR-29c-5p表达组与高和低CPEB4表达组之间40名GBC患者的OS率。
我们使用一种补充方法来检查CPEB4功能的获得和丧失。具体来说，我们用缺少3'UTR的CPEB4表达载体敲低了GBC-SD细胞中CPEB4的表达或恢复了NOZ细胞中CPEB4的表达。CPEB4表达的恢复增强了表达miR-29c-5p的NOZ细胞的增殖和集落形成（图6a和b）。同样，流式细胞仪分析表明CPEB4表达的恢复恢复了因miR-29c-5p过表达引起的细胞周期停滞（图6c）。此外，CPEB4的恢复显着减弱了miR-29c-5p介导的对GBC细胞迁移和侵袭的抑制作用（图6d 和补充图S5B）。通过蛋白质印迹进一步分析了MAPK / ERK信号通路中的候选蛋白质。结果表明，异位表达或敲低miR-29c-5p会影响p-MEK，p-ERK和p-AKT的水平，并且分别通过重新引入或抑制CPEB4来消除这些作用（图6e）。这些发现支持以下观点：CPEB4代表GBC中miR-29c-5p的肿瘤抑制功能的潜在机制中的重要靶标。
在多种肿瘤中，TGF-β是与炎症和转移相关的最有力的细胞因子之一。然而在GBC中很少有功能性实验报道miRNA与TGF表达之间的相关性。作者研究了TGF- β是否参与GBC的发病机制以及miR-29c-5p / CPEB4诱导的肿瘤转移。为此，用TGF- β处理了GBC细胞（补充图S5A和D）。有趣的是，发现TGF- β治疗可显着降低miR-29c-5p的表达并增加CPEB4的水平mRNA，提示TGF- β负调控GBC细胞中的miR-29c-5p / CPEB4轴（图7a和b）。接下来，作者检测了miR-29c-5p模拟物是否可以抑制TGF- β诱导的GBC转移和侵袭。如所预期的，通过与pre-miR-29c一起孵育来减弱TGF- β诱导的细胞增殖和迁移（图7c和d以及补充图S5C）。这些结果通过针对几种EMT相关蛋白的蛋白质印迹分析进一步证实（图7e）。这些结果表明miR-29c-5p / CPEB4轴在TGF- β诱导的肿瘤转移中具有关键作用（图7f），并强烈支持以下结论：miR-29c-5p在介导炎症和癌症两者之间的联系中起重要作用。
文献总结：
研究结果表明，miR-29c-5p在GBC中显着下调。体内外实验表明TGF-β通过MAPK / ERK途径诱导的miR-29C-5P的表达降低在胆囊癌细胞增殖与转移中具有重要作用以及通过直接靶向CPEB4的转录诱导上皮间质转化。这些结果为TGF- β介导的GBC转移的分子发病机理提供了新的机制研究，并为GBC的治疗提供了潜在的新治疗靶标。
原文地址：https://www.nature.com/articles/cdd2016146
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