Nat Rev | R-环和RNA-DNA杂交序列的来源与功能

原创 huacishu 图灵基因 2022-05-24 09:14 发表于江苏

收录于合集#前沿分子生物学机制

撰文：huacishu

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亮点：

1、作者讨论了目前对R-环和RNA-DNA杂交来源的理解，抑制和解析这些结构的机制，这些结构对DNA修复和基因组稳定性的影响，以及治疗病理性R-环的方法；

2、作者说明建立临床有用的检测方法，以测量患者体内R-环的积累，了解R-环和相关的基因组不稳定性如何促进发病机制，并开发新的策略来缓解或利用治疗中的R-环相关缺陷是至关重要的。

哈佛医学院Lee Zou教授课题组在国际知名期刊Nat Rev Mol Cell Biol在线发表题为“Sources, resolution and physiological relevance of R-loops and RNA–DNA hybrids”的论文。RNA–DNA杂交产物在转录、DNA复制和DNA修复过程中产生，是这些过程中的关键中间体。当RNA-DNA杂交在双链DNA中稳定形成时，它们会取代其中一条DNA链，形成一个称为R环的三链结构。R-环在基因组中广泛存在，并在活性基因中富集。R-环在调节基因表达和染色质结构方面起着重要作用，但它们也对基因组稳定性构成威胁，尤其是在DNA复制过程中。为了保持基因组稳定，细胞已经进化出一系列机制来防止异常的R环积累。尽管R-环可导致DNA损伤，但它们也由DNA损伤诱导，并作为DNA修复的关键中间体，如转录偶联修复和RNA模板DNA断裂修复。当R-环的调节出现错误时，病理性R-环积累，从而导致神经退行性变和癌症等疾病。在这篇综述中，作者讨论了目前对R-环和RNA-DNA杂交来源的理解，抑制和解析这些结构的机制，这些结构对DNA修复和基因组稳定性的影响，以及治疗病理性R-环的方法。

在复制过程中，新生RNA与RNA聚合酶活性部位内的DNA模板发生非常短暂的退火，产生短暂的RNA-DNA杂交，可以通过一个专用通道释放新生RNA来解决。当新生的RNA短暂地重新退火回到RNA聚合酶后面的模板上时，就会形成R环。在RNA聚合酶II（Pol II）转录的基因中，共转录R环主要聚集在启动子、转录起始位点和转录终止位点（TTS）。启动子上的R-环参与转录激活，富含G的“终止子”元件附近的Pol II暂停位点上的R-环有助于转录终止和基因抑制染色质的形成（图1a）。端粒重复序列RNA（TERRA）是Pol II从端粒和端粒下游区域转录的一种长非编码RNA（lncRNA）。TERRA含有UUAGG重复序列，可以与富含C的端粒DNA链杂交。在人类细胞中，TERRA与端粒相关，与许多端粒结合蛋白和染色质调节剂相互作用，对端粒的维持很重要。在人类细胞的端粒上检测到TERRA生成的R-环（图1b）。最近的一项研究表明，由UUAGG重复序列组成的RNA足以通过RAD51重组酶介导的机制形成反式端粒R环，并且端粒R环的形成增加了端粒的脆弱性。因此，端粒R环允许TERRA与端粒结合并维持端粒，但它们也会产生基因组不稳定性。TERRA和端粒R环的适当调节可能对端粒的正常功能很重要。与端粒类似，着丝粒也由Pol II转录。组蛋白H3样着丝粒蛋白A（CENPA）和着丝粒蛋白C（CENPC）与着丝粒的结合需要着丝粒RNA，使这些RNA成为着丝粒的重要结构成分。着丝粒R环很容易在有丝分裂染色体中检测到。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶ATR在有丝分裂期间以R-环依赖的方式被招募到着丝粒（图1b）。然而，尽管着丝粒R环对着丝粒组装和功能很重要，但它们也是复制压力的来源。因此，着丝粒R-环对着丝粒既有积极的影响，也有消极的影响。

复制相关RNA-DNA杂交最显著的来源是滞后链复制，在此过程中，DNA聚合酶-α（Polα）-引物复合物每200个核苷酸合成一个8-10个核苷酸长的RNA引物（图2a）。在DNA复制过程中经常产生的另一种形式的RNA-DNA杂交是错误结合的核糖核苷酸。细胞中高浓度的核糖核苷酸会导致它们通过复制DNA聚合酶错误融合，其速率估计为每7.6kb一次，相当于每个细胞分裂100万个位点。错误整合的核糖核苷酸被认为是最常见的基因组病变，需要核糖核苷酸切除修复（RER）才能去除（图2a）。在人类细胞中，在DNA双链断裂（DSB）位点检测到RNA-DNA杂交。这些杂交是通过DNA杂交在双歧杆菌的单链DNA上形成的，或者是通过RNA侵入双链DNA形成的。DNA损伤诱导的lncRNAs（dilncRNAs）也在DSB上形成杂交。dilncRNAs的合成与通过MRE11–RAD50–NBS1（MRN）复合物招募到DSB的Pol II有关（图2b）。Pol III也有助于DSBs的RNA合成。这些发现表明，DSB的从头RNA合成促进了RNA-DNA杂交的形成。然而，在特定位点诱导DSB后，RNA-DNA杂交的全基因组图谱显示，杂交水平的增加主要发生在转录活性区域，这表明预先存在的RNA转录物在损伤诱导的RNA-DNA杂交的形成中起主要作用（图2b）。一直以来，当活性氧（ROS）在特定染色体位点诱导DSB和单链断裂（SSB）时，杂种只在存在局部转录的情况下被检测到。有人提出，DSB和SSB暂停Pol II会导致R环的形成。DSB和SSB如何暂停Pol II尚不清楚。在活性基因的R-环中暴露单链DNA也可能允许从头合成RNA，从而有助于在DNA损伤位点形成RNA-DNA杂交。

R环和复制叉之间的碰撞是细菌、酵母和人类细胞中DNA损伤的一个来源（图3a）。研究表明，R-环激活ATR需要复制叉逆转和结构特异性内切酶MUS81，这表明复制叉在遇到R-环时被迫进行逆转和MUS81介导的加工。在具有高水平R-环的细胞中，ATR抑制导致MUS81依赖性DNA损伤增加，这表明R-环诱导的DNA损伤是由停滞的分叉、R-环或两者的MUS81裂解引起的。R-环可能通过多种机制干扰复制分叉进程。R-环中的RNA–DNA杂交和暂停的Pol II或R-环诱导的正超螺旋可能干扰复制叉的进展并导致复制叉崩溃。拓扑异构酶1（TOP1）可以放松DNA的超螺旋，抑制TTS处的DNA损伤，在TTS处会发生正面碰撞（图3b）。在容易发生正面碰撞的TTS上，R环诱导组蛋白H3 Lys9的基因抑制性甲基化和染色质蛋白1（HP1）的募集（图3c）。R-环还与高水平的磷酸化组蛋白H3 Ser10以及着丝粒和着丝粒周围区域（图3c）的染色质紧密相关，这些区域容易受到复制应激。R环中移位的单链DNA是DNA修饰酶的潜在底物。在B细胞免疫球蛋白重组过程中，激活诱导的胞苷脱氨酶（AID）将开关区R环暴露的单链DNA中的胞嘧啶转化为尿嘧啶。AID产生的尿嘧啶被尿嘧啶DNA糖基化酶处理成脱落位点，这直接阻止DNA聚合酶，并通过碱基切除修复产生SSB，在复制过程中转化为DSB（图3d）。除AID外，其他胞苷脱氨酶，如APOBEC3A和APOBEC3B，也可能攻击R环中的单链DNA，并产生碱性位点和DNA断裂。

抑制共转录R-环对于防止R-环和复制叉的碰撞非常重要。例如，TOP1解决了TTS上与R-环相关的DNA超螺旋，以抑制复制叉和R-环正面碰撞导致的DNA损伤。许多DNA修复蛋白参与复制叉与R环碰撞的反应。解旋酶FANCM在体外解开端粒RNA–DNA杂交，并在端粒交替延长（ALT）期间抑制复制应激。BLM还能在体外解开RNA-DNA杂交，抑制细胞中的R环。BRCA1、FANCM和BLM协同解决ALT端粒上R-环诱导的复制应激。DDX19在DNA损伤后以ATR依赖的方式进入细胞核，以去除R环（图4b）。结构特异性核酸酶，如MUS81和MRE11，也参与R-环的抑制，可能是通过切割R-环和复制叉碰撞诱导的DNA结构。一些参与DNA损伤反应的蛋白质，如丝氨酸蛋白激酶ATM（ATM）、ATR、CHK1和CHK2，抑制R-环。这些检查点蛋白被认为对防止复制叉与R-环的碰撞或修复折叠叉很重要。MUS81在R-环处处理反向分叉激活ATR61，允许Pol II通过停滞的分叉，并最终通过RAD52的链退火和LIG4的缺口连接促进分叉重新启动（图4c）。这样的过程让人想起但不同于断裂诱导复制（BIR）。有证据表明，复制叉可以绕过R环，或者通过复制螺旋酶的RNA-DNA杂交展开，或者通过在R环下游重新复制（图4b）。如上所述，复制叉和R-环的共定向碰撞降低了R-环水平，可能是因为解旋酶MCM（CMG复合物的一部分）可以解开前导链上的RNA-DNA杂交。几种染色质修饰剂，包括多梳抑制复合物1（PRC1）、组蛋白乙酰转移酶KAT8和组蛋白脱乙酰基酶（HDAC）SIN3A复合物，都与抑制R-环有关（图4）。由于PRC1和SIN3A作为转录抑制物发挥作用，在缺乏它们的情况下，R-环的积累可能直接由转录增加引起。然而，SIN3A也通过与THO复合物亚单位THOC1的物理相互作用抑制R-环的积累。含有蛋白质2（BRD2）和BRD4的乙酰赖氨酸受体通过阻止Pol II暂停（BRD4）或通过招募TOP1（BRD2）抑制R-环的形成。这些因素中的大多数在DNA复制和DNA损伤反应中起着已知的作用（图4a，b），在与复制叉发生碰撞时促进R环处理。由于引用的研究是在循环细胞中进行的，目前尚不确定上述因子在转录过程中在多大程度上也直接和特异性地抑制R-环有关。这个问题可以用G1期细胞或非循环细胞进一步研究。

已经提出了几种类型的RNA-DNA杂交体来招募DNA修复蛋白到DSB中。DSB诱导的小RNA（diRNAs）和DNA损伤反应小RNA是由DSB产生的非编码小RNA。diRNA与Argonate 2和RAD51形成复合物，可能通过diRNA与DNA杂交，促进RAD51定位于DSB（图5a）。DNA损伤反应小RNA来源于双链RNA，双链RNA在DSB转录。DiLncRNA在DSB处形成RNA–DNA杂交，从而促进HR蛋白BRCA1、BRCA2和RAD51的招募（图5a）。BRCA1与RNA-DNA杂交结合，核糖核酸酶H处理减少了S期和G2期细胞中的BRCA1病灶，表明BRCA1可能是R环的传感器。当ROS在特定的染色体位点被局部诱导时，R-环以转录依赖的方式产生，这表明RNA转录本在DNA损伤位点与DNA杂交（图5a）。DNA末端切除对于DNA修复途径的选择非常重要。DSB上的R环和RNA-DNA杂交是否以及如何影响DNA末端的切除仍有争议。在酵母中，RNaseH1的过度表达会破坏DSB处的RNA-DNA杂交，并诱导过度切除，这表明杂交会限制切除。然而，在人类细胞中，以杂交依赖方式定位于DSB的RAD52招募XPG来切割R环并促进单链DNA的形成（图5b）。Pol III在DSB处产生RNA-DNA杂交，Pol III的缺失也会减少切除（图5b）。在酵母中，当RNaseH和逆转录酶活性缺失时，RNA转录本可以作为DSB修复的模板。DNA模板修复DSB需要Rad52，它可以促进RNA-DNA杂交的形成以及同源单链RNA和单链DNA之间的链交换。假设RNA转录本与DSB上的3′突出部分杂交，从而允许RNA模板DNA合成（图5c）。此外，RNA转录本可能起到将DNA两端连接在一起的分子桥梁的作用。在RAD52存在的情况下，可以与DSB两侧的单链DNA进行退火的RNA寡聚体能够在体外连接DNA末端。RNA是否能在细胞内修复DSB期间起到桥梁作用，以及这种机制在体内的重要性尚不清楚。

许多致癌事件可增加R-环水平和相关的基因组不稳定性。激活的癌基因和细菌致癌物可增加R-环的形成，从而提高复制压力和基因组不稳定性（图6a）。在编码剪接因子SRSF2和U2小核RNA辅助因子1（U2AF1；也称为U2AF35）的基因中，发现了在骨髓增生异常综合征（MDS）中普遍存在的疑似致癌突变，可能通过增加Pol II暂停或其他机制，诱发R环和复制应激（图6b）。癌基因MYCN和MDM2分别与BRCA1或染色质修饰剂PRC1协同作用，抑制R-环的形成。MYCN和MDM2的R-环抑制效应可能使癌细胞能够耐受高水平的转录和复制应激。MYCN和其他癌基因（如HRA-V12）之间的差异可以通过时间来解释，因为MYCN在癌基因诱导后的最初几个小时内抑制R-环，而HRA-V12诱导的R-环在诱导3天后被检测到。参与修复复制相关DNA损伤的因子，如FANCM、MRN复合物、BRCA1和BRCA2，以及激活细胞周期检查点所需的因子，如ATM，起到肿瘤抑制作用。这些蛋白质的R-环抑制功能对于防止R-环和复制之间的冲突非常重要，从而限制增殖细胞中促进癌症的基因组不稳定性（图6b）。TERRA和端粒R环的调节在一部分人类癌症中发生了改变。TERRA通常在利用ALT途径延长端粒的癌细胞中上调。ATRX是一种作用于亚末端的染色质重塑剂，在ALT阳性癌症中经常发生突变，ATRX的缺失增加了TERRA水平（图6c）。解旋酶FANCM具有解开端粒R环的能力，并且它将ALT阳性癌细胞中的ALT活性限制在可耐受的水平（图6d）。BRCA1直接结合TERRA并抑制端粒R环和DNA损伤（图6d）。

MDS和急性髓系白血病中常见的几种剪接因子突变，如U2AF1-S34F和SRSF2-P95H，被证明会增加细胞中的R环。这些剪接体突变体以R-环依赖的方式诱导ATR反应。此外，在表达剪接体突变体的细胞中抑制ATR会增加R-环依赖性DNA损伤，这表明ATR保护细胞免受异常R-环的损伤。因此，抑制ATR是利用癌细胞R环相关脆弱性的一种有吸引力的策略（图7a）。MDS中发现的剪接因子突变影响许多基因的选择性剪接。RNA剪接抑制剂通过加剧剪接缺陷来杀死MDS细胞。在表达U2AF1-S34F的细胞中，剪接抑制剂也能增加R环并刺激ATR反应（图7b）。因此，剪接抑制剂增加了表达U2AF1-S34F的细胞对心房颤动的敏感性。因此，心房颤动和增加R-环水平的药物联合治疗MDS可能是有效的。如上所述，EWS–FLI表达增加Pol II延伸和R-环形成，并激活ATR途径。由于ATR对HR和R-环反应都至关重要，并且PARP抑制剂选择性地杀死HR缺陷细胞，肉瘤细胞的HR缺陷使其对ATR和PARP抑制剂敏感（图7c）。当R-环在具有高GC的序列中形成时，移位的富含G的单链DNA可以产生G4s。G4配体稳定G4s使R环更持久，从而增强其对基因组稳定性的影响。此外，G4s本身可以干扰DNA复制并导致DNA损伤。在BRCA2缺陷细胞中，G4配体以R-环依赖的方式诱导DNA损伤（图7d）。G4稳定配体还干扰转录区ROS诱导损伤部位R环的解析，从而影响DSB修复。端粒R环与G4s相关，在ALT+癌细胞中，G4稳定配体可增强ALT活性及其相关的端粒不稳定性。这些发现表明，G4稳定药物可用于开发癌细胞中与R环相关的基因组不稳定性。

由于新的分析工具和技术的发展，对R-环和RNA-DNA杂交的来源、分辨率和影响的理解在过去几年中有了很大的扩展，这使能够在整个基因组中绘制R-环，识别R-环相关蛋白，并跟踪R-环在各种生物环境中的作用。R-环对基因组的影响也是多种多样的，这取决于R-环的产生时间和方式、R-环的丰度和稳定性，以及R-环与哪些蛋白质相互作用。虽然已经确定了许多R环的调节器，但仍然不知道这些调节器在细胞中如何协同工作。今后，研究不同类型的R-环和RNA-DNA杂交体是如何产生、加工和分解的，以及它们在特定的染色体、细胞和组织环境中如何发挥作用，将是至关重要的。这项工作应该包括更详细地研究细胞中R-环介导的基因组不稳定性，以及DNA复制对R-环介导的基因组不稳定性的相对贡献。建立临床有用的检测方法，以测量患者体内R-环的积累，了解R-环和相关的基因组不稳定性如何促进发病机制，并开发新的策略来缓解或利用治疗中的R-环相关缺陷是至关重要的。

教授介绍

Lee Zou教授就职于哈佛医学院。癌症是一种复杂的疾病，由基因组中的遗传和表观遗传改变驱动。为了防止这些有害的改变，细胞进化出了一个复杂的信号网络，称为DNA损伤检查点，用来检测基因组中的问题并发出信号。在癌症发展过程中，癌基因的激活和抑癌基因的丢失导致基因组不稳定，使癌细胞越来越依赖于特定的DNA修复和检查点信号蛋白生存。Lee Zou教授实验室特别感兴趣的是了解检查点如何检测DNA损伤和基因组不稳定性，以及检查点如何成为癌症治疗的靶点。目前的研究主要集中于ATR和ATM的激活，这是两个主要检查点通路的主要传感器激酶。此外，正在开发新的策略，在靶向癌症治疗中利用不同癌细胞的基因组不稳定性和检查点成瘾性。其它的研究领域还包括：感知DNA损伤、复制、压力和转录问题；RNA、DNA修复和基因组完整性；癌症基因组学、肿瘤进化和靶向癌症治疗。

参考文献

Petermann E, Lan L, Zou L. Sources, resolution and physiological relevanceof R-loops and RNA-DNA hybrids. Nat Rev Mol Cell Biol.2022;10.1038/s41580-022-00474-x. doi:10.1038/s41580-022-00474-x