核心问题解答：条带越亮（颜色越深）代表蛋白含量越多
在Western Blot（蛋白质印迹）实验中，结果通常以条带的形式呈现。
检测原理：通过抗体来特异性地识别目标蛋白（在这个实验中是泛素化修饰的蛋白）。
信号强度：抗体上通常连有能发光或显色的物质。目标蛋白的量越多，结合的抗体就越多，产生的信号就越强。
图像呈现：在最终的图像上，信号越强，条带的颜色就越深、越浓（在黑白图中看起来就是越黑越亮）。
所以，结论是：条带越深/越浓/越亮，代表该位置检测到的蛋白含量就越高。
华大测序胶图说明：
2025/8/14 补充知识：
这张图非常清晰地展示了 Western Blot (WB) 实验的核心流程。作为一种经典的蛋白质检测技术，它广泛应用于分子生物学研究中，比如您在研究中可能需要检测胁迫条件下某些关键蛋白的表达变化。
下面我们来详细讲解每一步的目的和操作。
- 上样 (Sample Loading)
目标: 将处理好的蛋白质样品加入到凝胶的孔中，准备进行分离。
具体操作:
蛋白提取与定量: 首先需要从您的棉花花药样品（或其他组织）中提取总蛋白，并用BCA或Bradford等方法测定蛋白浓度，确保每个泳道加载的蛋白总量一致或在同一水平，这是后续进行半定量比较的基础。
样品制备: 取等量的蛋白，加入SDS-PAGE上样缓冲液（Loading Buffer）。这个缓冲液通常是蓝色的，含有SDS（使蛋白变性并带上均匀负电荷）、还原剂（如DTT或β-巯基乙醇，用于打开蛋白质的二硫键）、甘油（增加样品密度，使其能沉入加样孔）和溴酚蓝（作为指示剂，用于判断电泳进程）。然后将样品进行加热（通常是95-100°C，5-10分钟），使蛋白质充分变性，解离成线性肽链。
上样: 用移液枪小心地将处理好的蛋白样品和分子量标准品（Protein Marker/Ladder）分别注入聚丙烯酰胺凝胶（PAGE gel）的加样孔中。Marker可以帮助我们判断目标蛋白的分子量大小。
- 电泳 (Electrophoresis)
目标: 根据蛋白质分子量的大小，将混合的蛋白质样品分离开。
具体操作:
将凝胶放入充满电泳缓冲液的电泳槽中，接通电源。
由于SDS使所有蛋白质都带上了均匀的负电荷，它们会从负极向正极移动。
凝胶本身是一个有网格结构的介质，分子量小的蛋白质在凝胶中受到的阻力小，跑得快、跑得远；分子量大的蛋白质受到的阻力大，跑得慢、跑得近。
电泳一直进行到蓝色的染料指示剂跑到凝胶底部为止。电泳结束后，凝胶上就形成了一系列按分子量大小排布的、肉眼不可见的蛋白质条带。
- 转膜 (Transfer / Blotting)
目标: 将凝胶中分离的蛋白质转移到一张固相支持物上，通常是PVDF膜或硝酸纤维素（NC）膜。
具体操作:
制作一个“三明治”结构：海绵垫-滤纸-凝胶-PVDF/NC膜-滤纸-海绵垫。关键是确保凝胶和膜紧密贴合，中间不能有气泡。
将这个“三明治”放入转膜槽中，施加电流。电流方向与凝胶垂直，使带负电的蛋白质从凝胶中“跑”出来，并牢固地结合（吸附）到膜上。这个过程就像一个复印机，把凝胶上的蛋白图谱“复印”到了膜上。
为什么要转膜？ 因为凝胶易碎且后续抗体难以渗透，而PVDF/NC膜则更坚固、便于操作，且能让抗体更容易地接触到蛋白。
- 膜封闭 (Blocking)
目标: “封住”膜上没有结合蛋白质的空白区域，防止后续加入的抗体非特异性地结合到膜上，从而降低背景信号，使结果更干净。
具体操作:
将转印好的膜浸入封闭液中，在摇床上缓慢摇动孵育一段时间（通常室温1-2小时）。
常用的封闭液是含有脱脂奶粉（通常5%）或牛血清白蛋白 (BSA)（通常3%-5%）的缓冲液（如TBST或PBST）。这些无害的蛋白质会占据膜上所有的“空位”。
- 一抗孵育 (Primary Antibody Incubation)
目标: 用特异性识别目标蛋白的抗体（一抗）来“标记”出我们感兴趣的蛋白。
具体操作:
将封闭好的膜放入稀释好的一抗溶液中，在摇床上缓慢孵育（通常4°C过夜或室温1-2小时）。
一抗会像精确制导的导弹一样，在膜上成千上万种蛋白质中，只结合到它的目标蛋白上。例如，如果您想检测泛素化蛋白，这里使用的一抗就是抗泛素（anti-ubiquitin）抗体。
孵育结束后，需要用洗涤液（如TBST）多次洗膜，洗去未结合的、游离的一抗。
- 二抗孵育 (Secondary Antibody Incubation)
目标: 结合到一抗上，并携带一个“信号报告系统”（通常是酶），用于后续的信号检测。
具体操作:
将洗涤后的膜放入稀释好的二抗溶液中，在摇床上室温孵育1-2小时。
二抗是用来识别一抗的抗体。例如，如果一抗是“兔源”的，那么二抗就必须是“抗兔”的（如羊抗兔IgG）。
二抗上通常偶联了辣根过氧化物酶 (HRP) 或碱性磷酸酶 (AP)。
孵育结束后，同样需要用洗涤液多次、充分地洗膜，洗去游离的二抗，这一步对减少背景信号至关重要。
- 信号捕获 (Signal Detection)
目标: 让二抗上携带的酶与底物反应，产生可被检测的信号（如发光或显色），从而让目标蛋白的位置“显现”出来。
具体操作:
最常用的方法是化学发光法 (ECL)。将ECL试剂（包含发光底物）滴加到膜上，二抗上的HRP酶会催化底物发光。
将膜迅速放入化学发光成像系统中（像一个高精度的暗箱相机），捕捉发出的光，并转换成数字图像。您在第一张图中看到的条带就是这样得到的。
- 结果反馈 (Result Analysis)
目标: 分析最终得到的图像，得出实验结论。
具体操作:
定性分析: 观察在目标蛋白的预期分子量位置（参照Marker）是否存在条带。有条带说明蛋白存在，没有则说明可能不存在或表达量极低。
半定量分析: 通过软件（如ImageJ）分析条带的灰度值（即亮度/深度），可以比较不同样品中目标蛋白的相对表达量。例如，比较高温处理和常温对照组，看条带是变深了（上调表达）还是变浅了（下调表达）。
问题：条带中的marker大小从下到上分子量依次增大，也就是说蛋白是从上端跑到下端是吗？
是的，完全正确！
这正是SDS-PAGE凝胶电泳的基本原理。
上样位置 (Loading Position): 蛋白质样品和Marker都是从凝胶顶部的加样孔 (well) 加入的。
电泳方向 (Running Direction): 在电泳过程中，整个体系的上方是负极 (-)，下方是正极 (+)。由于蛋白质在经过SDS处理后都带上了均匀的负电荷，它们会被上方的负极排斥，同时被下方的正极吸引，因此会集体从上端往下端跑。
分离原理 (Separation Principle): 凝胶就像一个多孔的筛网。
小分子量蛋白: 体积小，在“筛网”中穿行时受到的阻力小，所以跑得快，最终会停留在凝胶的下端。
大分子量蛋白: 体积大，穿行时受到的阻力大，所以跑得慢，最终只跑了很短的距离，停留在凝胶的上端。
所以，当您看到Marker的条带从下到上分子量依次增大时，这正好证明了所有蛋白（包括您的样品蛋白和Marker蛋白）都是从上往下跑，并且在这个过程中根据分子量的大小被成功分开了。
简单总结一下：
起点: 凝胶上端的加样孔。
终点方向: 凝胶下端。
跑得最远的 (最下方): 分子量最小的蛋白。
跑得最近的 (最上方): 分子量最大的蛋白。
