scATAC文献：利用scRNA-seq和scATAC-seq研究灵长类中间神经元发育过程中的进化保守和非保守调控
INTRODUCTION
人脑复杂有序的神经网络主要由兴奋性谷氨酸神经元和含ɣ-氨基丁酸（GABA能）的抑制性中间神经元组成。中间神经元是高度多样的神经元，具有不同的形态、连接性和生物学功能。兴奋/抑制平衡失调与许多神经发育和神经精神障碍有关，如自闭症谱系障碍和精神分裂症。在大脑发育过程中，只有少数中间神经元起源于局部区域并发挥作用，而几乎所有其他中间神经元都来自神经节隆起（GEs），即胚胎阶段的暂时性结构。位于丘脑和尾状核之间的GEs是中间神经元的起源。GEs可分为三个亚区，包括外侧、内侧和尾侧神经节隆起（LGE、MGE和CGE）。
每个亚区表达特定的基因，并产生针对整个大脑的时间和空间上不同的中间神经元。MGE主要产生迁移至大脑皮质、纹状体和苍白球的GABA能细胞，其特征是NKX2-1和LHX6的表达。LGE衍生的中间神经元主要由纹状体中棘神经元（MSN）和嗅球中间神经元的前体组成，可分别通过ISL1和CHD7的表达来识别。CGE主要产生5HT3aR+皮质中间神经元，具有NR2F1和NR2F2的特异性表达。GE发育过程中基因和调控网络的特异性表达有助于区域细胞多样性和神经元间迁移。
单细胞RNA-seq已被应用于发育神经科学的研究中。与从组织中生成混合表达数据的传统bulk RNA-seq相比，scRNA-seq可以提供单个细胞的转录谱。具有如此高分辨率的技术可以区分不同的细胞类型，并促进我们对复杂神经系统的研究。
对小鼠的几项单细胞研究揭示了胚胎发育过程中GE中间神经元的分子和转录特征的多样性。然而，关于灵长类动物GE发育过程中抑制性神经元生成的研究很少，由于缺乏或缺乏高质量的转录分析，啮齿类动物和灵长类动物之间的保护性和异质性仍然有限。此外，复杂的细胞增殖、空间差异、谱系决定和中间神经元迁移背后的复杂调控网络仍不清楚。
在这项研究中，我们使用scRNA-seq和单细胞分析技术，通过高通量测序（scATAC-seq），这项技术能够捕获染色质上的开放区域，以研究人类和猕猴胚胎中GEs的转录轨迹。我们发现，在人类和猕猴之间发育的GEs中，大多数基因调控网络都很保守，包括参与细胞增殖、细胞命运决定和迁移的网络。我们在不同的人类GE区域发现了对细胞命运决定可能重要的基因。此外，我们还发现了新的调控途径，可能与MGE和LGE的命运决定以及GEs中的细胞迁移有关。重要的是，在人类发育中的GEs中证实了外放射状胶质细胞(outer radial glial cells)的存在。
RESULTS
Cell diversity in the early developmental stages of primate GEs
为了研究和比较灵长类GEs的发育特征，我们对三只食蟹猴和两个人类胎儿的GEs进行了基于液滴的scRNA-seq分析。猕猴样本来自第7周、第10周和第12周，当时GEs仍处于早期发育阶段。从可能处于可比发育窗的GW 9和GW 13中采集人类样本（图1a）。
在测序、作图和质量控制之后，我们从人类获得13782个细胞，从猕猴获得29269个细胞。然后，来自两个物种的数据被Seurat3整合。使用无监督方法对不同的细胞进行聚类（图1b），我们检测到21个细胞簇。每个簇都用已知的 marker进行注释，用于对这些细胞进行分类（图1b）。
我们从邻近的大脑皮层中移除了两簇表达NRN1和SLA46,47的兴奋性神经元。我们还发现，通过相应的标记物CX3CR1和SLC4A1识别的小胶质细胞和血细胞簇也被移除。在剩余的GE衍生细胞中，我们可以通过差异基因表达分析将细胞与GE祖细胞和有丝分裂后细胞区分开来。包括放射状胶质细胞（RGCs）和GEs中间祖细胞（IPCs）在内的神经祖细胞表现出NES、VIM或ASCL1、DLL150的高表达水平（图1c、d）。
TOP2A51可以标记细胞周期中的增殖细胞（图1c，d）。有丝分裂后的细胞可以通过区域特异性标记进一步定义（图1c）。MGE由特异性表达NKX2-1和LHX6的细胞组成，而MEIS2、ISLR2在LGE中表达，NR2F1、NR2F2在CGE中表达（图1d）。然后，我们计算了每种细胞类型的人类和猕猴细胞的标准化细胞比率，这在river plot中可见，表明人类和猕猴的GE细胞分区之间没有显著差异（图1e）。基于人类和猕猴不同细胞类型之间基因表达的相似性分析也证明了整合这两个物种数据的准确性（图1f）。
为了展示灵长类GEs细胞发育的轨迹，我们进行了RNA速度分析（scVelo），这是一种通过重建转录变化的发育序列来推断轨迹的方法。正如所预测的，来自GE祖细胞的细胞增殖并生成IPCs，然后分化成MGE、LGE和CGE中的各种谱系（图1g）。总之，我们的分析证实了猕猴和人类之间的基本进化保守性，并揭示了人类和猕猴的细胞多样性和发育轨迹。
