Identification of tumour immune infiltration-associated snoRNAs (TIIsno) for predicting prognosis and immune landscape in patients with colon cancer via a TIIsno score model
通过 TIIsno 评分模型鉴定肿瘤免疫浸润相关 snoRNA (TIIsno) 以预测结肠癌患者的预后和免疫状况
发表期刊： EBioMedicine
发表日期： 2022 Feb 7
doi:10.1016/j.ebiom.2022.103866
一、背景
结肠癌 (CC) 是导致人们肿瘤相关死亡的主要原因。MSI-H/dMMR 是免疫检查点抑制剂治疗效果的主要预测因子。然而，在 10-15% 携带 MSI-H/dMMR 的结直肠癌 (CRC) 患者中，只有30-50%可以从免疫治疗中受益。除了 MSI-H/dMMR，尚未鉴定出可用于 CRC 免疫治疗的编码基因作为CRC免疫治疗的生物标志物。SnoRNA 在肿瘤微环境中起着至关重要的作用。同时，肿瘤浸润的免疫细胞可以塑造肿瘤微环境，从而控制免疫治疗效果。
二、材料与方法
1.数据来源
(1)GEO：GSE114765、GSE133145、GSE13563524、GSE107011
(2)CCLE 数据库：基于组织学亚型结肠癌细胞系的 RNA-Seq数据(TPM)
(3)UCSC Xena：TCGA的RNA-Seq数据(TPM)和结肠癌临床信息
(4)湘雅世界队列：在中南大学湘雅医院确诊的72名结肠癌患者的组织样本、69名患者的病理组织
(5)癌症分析的标志是通过基于“c2.cp.hallmark.v7.1.symbols”基因集的基因集变异分析（GSVA）R包进行的。GO富集是通过基于从 MSigDB 下载的“c5.all.v7.1.symbols”基因集的单样本基因集富集分析（ssGSEA）进行的。
(6)从TCGA数据集或基于TCGA数据集的研究中获得肿瘤基因突变负荷 (TMB)、新抗原、MSI状态、免疫评分和免疫亚型。
(7)肿瘤浸润性免疫细胞类型的标记基因来自Charoentong等人的研究，该研究分析了从37项研究中收集的366个免疫细胞的微阵列；19个抑制性免疫检查点来自Auslander等人和Hu等人的研究
2.实验流程
三、实验结果
1.肿瘤免疫浸润相关 snoRNA 的鉴定
为了最大限度地获得免疫细胞相关snoRNA的表达水平，作者在GEO数据库中筛选了过去10年的免疫细胞数据集，并确定了4个数据集（GSE14765, GSE133145, GSE135635,GSE107011）。这些数据集共包含188个RNA-Seq细胞样本，包括9个大类和21个亚分类免疫细胞类型（图2a-b）。然后，对所有snoRNAs的表达水平进行排序，表达水平大于0的snoRNAs作为候选snoRNAs。为了确定免疫细胞表达最多的snoRNAs，即所谓的管家snoRNAs，计算了候选snoRNAs的TSI分数。使用不同的TSI cut-off来降低维度并筛选出管家snoRNAs。此外，使用CCLE获取了43种结肠癌细胞系的RNA-Seq数据，并对所有肿瘤中的snoRNAs表达水平进行排序。当达到0.35时，TIIsno评分模型在OS和预测免疫微环境的方面的AUC最满意。在比较了免疫细胞和肿瘤细胞系中管家snoRNAs的表达水平后，作者确定了7个在肿瘤中表达明显降低而在免疫细胞中表达升高的snoRNAs（SNORD59A,SNORD63B, SNORD100, SNORD99, SNORD63, SNORD12C, SNORD19），将这些snoRNAs定义为肿瘤免疫浸润相关的snoRNAs（TIIsno）。
作者对 43 种结肠癌细胞系进行了分析，结果显示 7 种 snoRNA 的表达水平非常低。为了进一步确认 TIIsno 在免疫细胞中的表达水平，进一步分析了 TIIsno 的表达和来源。结果表明，每个 TIIsno 在所有 9 种免疫细胞类别中均有表达（图 2a）。大多数肿瘤免疫浸润相关的snoRNAs同时在21种免疫细胞亚型中高表达，这表明已经成功筛选出免疫细胞的管家snoRNAs。（图2b-i）。
2.TIIsno评分模型的开发
为了探索肿瘤免疫浸润相关的snoRNAs在结肠癌中的作用，作者利用TCGA获得结肠癌患者的snoRNAs表达和生存数据，选择TCGA-COAD-IIIumina-HiSeq作为训练集，利用随机生存森林（RSF）模型构建TIIsno评分模型。同时，使用surv_cutpoint算法获得最佳的TIIsno评分cut-off值为9.392。TIIsno得分高于cut-off的患者被定义为High组，而TIIsno得分低于截止值的患者被定义为Low组。同时，SNORD99和SNORD19的表达水平与TIIsno评分成反比，而SNORD59A、SNORD63B、SNORD100、SNORD63和SNORD12C的表达水平与TIIsno评分成正比（图3a）。除SNORD99外，其他TIIsno的表达水平在高TIIsno得分组和低TIIsno得分组之间有明显差异（图2j）。
此外，TIIsno评分模型的生存分析显示，高TIIsno评分组的预后比低TIIsno评分组差（图3b），多变量COX回归分析的P<0.001（图3d）。此外，3年生存率和5年生存率的预测ROC曲线下面积（AUC）分别为0.81和0.82，表明模型具有较强的预测能力（图3c）。
3.低TIIsno得分形成结肠癌的炎症微环境
为了评估TIIsno在结肠癌免疫微环境中的作用，作者探究了TIIsno与免疫细胞浸润和免疫检查点之间的关系。作者根据之前的研究用 ssGSEA 计算了 23 种肿瘤免疫浸润细胞相关基因组的激活水平，然后分析了TIIsno评分与肿瘤免疫浸润细胞激活水平之间的相关性。该分析显示，14种类型的肿瘤免疫浸润细胞与TIIsno评分之间存在着明显的相关性。所有类型的肿瘤免疫浸润细胞均呈负相关的，只有CD56dim自然杀伤细胞是正相关的（图4a）。此外，还分析了19个抑制性免疫检查点基因的表达水平与TIIsno评分之间的相关性，结果显示，9个免疫检查点的表达水平与TIIsno评分之间存在相关性。这9个检查点基因都是负相关的（图4b）。
作者使用了归一化富集分数算法进一步比较了高TIIsno得分组和低TIIsno得分组之间肿瘤免疫浸润细胞的差异。结果显示，高TIIsno得分组的11种免疫细胞的激活水平明显下降（图4c）。在上述分析中，这些免疫细胞浸润水平都与TIIsno评分呈负相关，表明两个分析的结果是一致的。基于TIIsno评分与免疫检查点的相关性分析，进一步分析了高TIIsno评分组和低TIIsno评分组的免疫检查点的表达。然而，结果显示与之前解释的分析不同，只有6个免疫检查点的表达水平在高TIIsno评分组和低TIIsno评分组之间有明显差异（CD274、CTLA4、CD86、CD276、HAVCR2、TIGIT）（图4d-k）。
为了进一步探讨TIIsno与免疫治疗的关系，作者分析了TIIsno评分与免疫评分、MSI状态、新抗原、TMB和免疫亚型之间的关系。发现TIIsno评分与免疫评分和MSI状态相关，而新抗原、TMB和免疫亚型在TIIsno评分高低组之间没有明显差异（图5）。TIIsno评分与免疫评分呈负相关，与低TIIsno评分组相比，高TIIsno评分组的免疫评分更低（图5a-b）。此外，MSI-H患者的TIIsno评分低于MSI-L和MSS患者（图5c）。分析表明，TIIsno得分低的患者更有可能从免疫治疗中获益。这与之前的结果一致，证明了在TIIsno得分低的患者种存在结肠癌炎症微环境（图4）。这些发现表明，TIIsno评分可能是免疫疗法反应的一个潜在生物标志物。
4.TIIsno 在结肠癌中的可能机制
为了探索TIIsno可能的生物学功能和机制，作者进行了GO分析。首先用ssGSEA计算每个样本的GO功能的激活水平，然后在TIIsno高分和低分组之间进行比较，发现共有 78 种生物学功能存在差异，其中大部分与免疫相关。TIIsno高分组中75种生物学功能下调，3种上调。在高TIIsno评分组中，白细胞介素1介导的信号通路负调控下调的程度最大，而T细胞受体基因的体细胞多样化上调程度最大（图6a）。
为了探索TIIsno在结肠癌中的其他作用，作者选择了50条癌症的标志性通路，计算通路的激活程度，并利用GSVA对其进行富集。结果显示，两个TIIsno评分组之间有26条标志性通路存在差异。在高TIIsno得分组种只有3条标志性通路得到了更大的激活度，而其他23条通路在低TIIsno得分组激活程度较高（图6b）。
5.TIIsno评分模型的验证
作者选择了另外两个独立的数据集进行分析（TCGA-COAD-IIIumina-GA队列，湘雅真实世界队列）验证TIIsno评分模型在结肠癌中的作用。这两个数据集的生存分析显示，高TIIsno评分组比低TIIsno评分组的预后更差，这与训练集的结果一致。同时，不管是用log-rank还是多变量COX回归分析，TIIsno评分模型都表现出了出色的预测性能。在TCGA-COAD-IIIumina-GA队列中，3年生存率和5年生存率的AUC分别为0.87和0.89，这些数值高于训练集中的数据。在湘雅的真实队列中，3年生存率和5年生存率的AUC分别为0.71和0.80。生存分析验证了TIIsno评分模型是结肠癌的重要独立预后因素（图7）。
选择了CD274和CTLA4这两个被批准用于临床治疗的免疫检查点评估TIIsno评分模型对免疫治疗反应的预测价值，以进一步验证该模型。作者收集了湘雅真实世界队列中69名患者的病理组织。组织被用来制作组织阵列和进行免疫组化染色。结果显示，与高TIIsno得分组相比，CD274和CTLA4在低TIIsno得分组中都有高表达。本研究进一步验证了TIIsno低分的患者比TIIsno高分的患者能在更大程度上从免疫治疗中获益(图8)。因此，TIIsno得分可能是免疫疗法反应的一个潜在生物标志物。
6.TIIsno特征的宿主基因
为了研究宿主基因是否能再现其snoRNAs，检查了TIIsno特征的宿主基因，有6个宿主基因：ATP5F1B, RPS12, SNHG12, HSPA9, ZFAS1, GNL3 (SNORD63和SNORD63B有相同的宿主基因）。作者分析了6个宿主基因在43种结肠癌细胞系中的表达水平，结果显示6个宿主基因大部分都有较高的表达水平，特别是RPS12和ATP5F1B（SNORD100和SNORD59A的宿主基因），而所有TIIsno特征的表达水平都很低。同时，在RSF模型的基础上对宿主基因特征进行了分析。宿主基因评分模型的生存分析显示，在训练队列中，宿主基因评分高的组别预后比低TIIsno评分组的预后要差，然而在测试队列中没有明显差异且AUC低于TIIsno签名（图S6a-d）。在对免疫微环境的分析中，宿主基因得分与免疫细胞和免疫检查点正相关关系不大，而TIIsno得分与免疫细胞和免疫检查点有负相关。（图S6e-f）。我们的分析表明，TIIsno 特征及其宿主基因在结肠癌中的作用可能不同。
四、结论
通过整合来自细胞系和肿瘤组织的表达数据以及来自数据库和真实世界队列的临床信息，成功鉴定了7个TIIsno，并构建了一个可以有效预测结肠癌患者预后的 TIIsno 评分模型，该模型具有良好的预测能力。研究表明，TIIsno评分是结肠癌患者的独立预后因素。此外，TIIsno评分作为免疫治疗反应的潜在生物标志物，可能为结肠癌的诊断和治疗提供新的线索。
