STAR下载地址
https://github.com/alexdobin/STAR
STAR的优势：
1.快速
2.推荐在RNAseq数据中使用。
STAR经常出现在哪些应用中：
10x cellranger中
RNAseq数据
单细胞数据。
下载安装：
tar -xzf 2.5.3a.tar.gz
cd STAR-2.5.3a
make STAR
第一步build index：
任何一款比对软件在比对前都需要对reference建立一个index，目的是为了减少比对时间或降低算法复杂度（算法使然）。
（1）使用现成的
10x genomics 的ref data中有现成的index文件。可以在官网下载下来直接用，但仅限于对应的ref。
比如你下载的是refdata-cellranger-GRCh38-3.0.0，
那么就有如下这些内容都是STAR 比对所需的index文件。并且STAR软件也自带下载了。
（2）自己构建：
需要用到的文件有genome.fa，gtf文件，两种即可，如下命令：
/cygene/work/STAR-2.5.3a/source/STAR \
--runThreadN 20 \
--runMode genomeGenerate \
--genomeDir ./ \
--genomeFastaFiles /home/database/refdata-cellranger-GRCh38-1.2.0/fasta/genome.fa \
--sjdbGTFfile /home/database/refdata-cellranger-GRCh38-1.2.0/genes/genes.gtf
$ sh work.sh
Aug 28 09:16:14 ..... started STAR run
Aug 28 09:16:14 ... starting to generate Genome files
Aug 28 09:17:10 ... starting to sort Suffix Array. This may take a long time...
Aug 28 09:17:24 ... sorting Suffix Array chunks and saving them to disk...
Aug 28 09:58:43 ... loading chunks from disk, packing SA...
Aug 28 10:01:53 ... finished generating suffix array
Aug 28 10:01:53 ... generating Suffix Array index
Aug 28 10:04:37 ... completed Suffix Array index
Aug 28 10:04:37 ..... processing annotations GTF
Aug 28 10:04:50 ..... inserting junctions into the genome indices
Aug 28 10:07:26 ... writing Genome to disk ...
Aug 28 10:07:28 ... writing Suffix Array to disk ...
Aug 28 10:09:05 ... writing SAindex to disk
Aug 28 10:09:22 ..... finished successfully
20个线程，大约耗时35分钟。消耗内存30G，
比对：
最简单的比对参数：
STAR --runThreadN $CPU --genomeDir $index_dir --readFilesIn [PE_1.fq] [PE_2.fq] --outFileNamePrefix [prefix.] --outSAMtype BAM SortedByCoordinate
得到的是bam文件。
Example：
STAR --runThreadN 20 --genomeDir $star_index
--readFilesCommand zcat
--outSAMtype BAM Unsorted
--readFilesIn sample1.fastq.gz.tagged.fastq.gz,sample2.fastq.gz.tagged.fastq.gz,sample3.fastq.gz.tagged.fastq.gz,sample4.fastq.gz.tagged.fastq.gz
--outFileNamePrefix L006
example2:
/cygene/work/STAR-2.5.3a/source/STAR \
--runThreadN 20 \
--genomeDir /cygene/work/02.dropEst/star \
--readFilesCommand zcat \
--outSAMtype BAM Unsorted \
--readFilesIn /cygene/work/02.dropEst/01_dropTag/sample1.fastq.gz.tagged.fastq.gz
example3: STAR 输出 unmapped reads (STAR 输出未必对上的reads)
STAR-2.7.6a/bin/Linux_x86_64/STAR --runThreadN 10 --genomeDir /path/to/database/mm10/STAR-2.7.6a --readFilesCommand zcat --readFilesIn myfile1_1.fq.gz myfile2_2.fq.gz --outFileNamePrefix myfile_prefix. --outSAMtype BAM SortedByCoordinate --outReadsUnmapped Fastx --outSAMattributes All
注意--outSAMattributes ALL指输出所有tag，如：NH:i:1 HI:i:1 AS:i:202 nM:i:3 NM:i:2 MD:Z:57T14C32 jM:B:c,-1 jI:B:i,-1 MC:Z:45S105M
默认情况下（指不加该参数）只有： NH:i:1 HI:i:1 AS:i:292 nM:i:3 这几个(好像是，待验证)，也可以指定只输出哪几个。因为有些下游分析软件会要求bam中药有NM才能统计。
关于STAR使用时的一些报错收集及解决方法：STAR报错合集。
STAR报错1：
STAR Segmentation Fault
$ STAR --runThreadN 10 \
--genomeDir refdata-cellranger-GRCh38-1.2.0/star \
--readFilesCommand zcat \
--readFilesIn /my/data/G88E3L2_R1.fq.gz /my/data/G88E3L2_R2.fq.gz \
--outFileNamePrefix mysamplename. \
--outSAMtype BAM SortedByCoordinate
Mar 27 11:00:11 ..... started STAR run
Mar 27 11:00:11 ..... loading genome
Mar 27 11:00:19 ..... started mapping
Segmentation fault (core dumped)
尝试解决方法：
1.不设置--runThreadN 仍然报错。
2.设置-- outSAMtype BAM Unsorted 仍然报错
3.设置 --genomeLoad LoadAndRemove --limitBAMsortRAM 10000000000 仍然报错
4.设置 --outSAMtype SAM 仍然报错
5.检查read1与read2 文件大小是否一致。结果文件大小一致。
6.换其他版本STAR，换了cellranger自带的STAR，不再报错。
STAR 报错2：
STAR Error: the read ID should start with @ or >
这个报错主要是你放入的fastq的压缩文件。
解决方法：设置读取文件参数：
--readFilesCommand zcat
或者
--readFilesCommand "gunzip -c"
STAR 报错3：
FATAL ERROR，number of bytes expected from the BAM bin does not agree with the actual size on disk:
解决方法：
- 设置 --outSAMtype SAM
- 或者更新到最新版本
STAR报错4：
$ STAR --version
2.7.3a
$ STAR --runThreadN 70 \
--genomeDir /hg19_star2.7_index \
--readFilesCommand zcat \
--readFilesIn XXX_R1.fastq.gz XXX_R2.fastq.gz \
--outFileNamePrefix samplename. \
--outSAMtype BAM SortedByCoordinate
Apr 10 22:15:50 ..... started STAR run
Apr 10 22:15:50 ..... loading genome
Apr 10 22:16:35 ..... started mapping
BAMoutput.cpp:27:BAMoutput: exiting because of *OUTPUT FILE* error: could not create output file GB001._STARtmp//BAMsort/20/16
SOLUTION: check that the path exists and you have write permission for this file. Also check ulimit -n and increase it to allow more open files.
Apr 10 22:16:37 ...... FATAL ERROR, exiting
解决方法：将--runThreadN 设置为20，原因还需要深究。
或更新到最新版本。
STAR报错5：
（这里忘记收集报错的截图了，以后遇到再补）
解决方法：
检查read1 和read2是否一致。多半是PE read 不一致造成。
STAR报错6：
EXITING because of fatal ERROR: not enough memory for BAM sorting:
解决方法：
根据报错信息，增加--limitBAMsortRAM 36949420170参数即可。可以设置数值大一点也没问题
总结：最新版bug少。
参考文献：
https://hbctraining.github.io/Intro-to-rnaseq-hpc-O2/lessons/03_alignment.html
https://academic.oup.com/bioinformatics/article/29/1/15/272537
如果你还在找其他比对软件，可以点这里：https://www.jianshu.com/p/bf0cd9bfa4b4
20210301修改补充
20200422修改补充
