3.4 讨论

隆线溞是一种重要的淡水微型甲壳动物，为了适应变化的环境，它可以从孤雌生殖转向有性生殖，称为周期性孤雌生殖。虽然先前的研究已经提到几个基因在隆线溞生殖转化过程中的重要性，但对生殖转化的分子机制仍不清楚。本研究对隆线溞的SF、PF和M个体进行了整合mRNA和miRNA的高通量测序分析，并探究隆线溞中的DEGs和DEMs并鉴定出涉及生殖转化的关键基因。

3.4.1 隆线溞生殖转化的转录组学研究

对生殖转化过程中DEGs的分析以及功能和通路富集分析为隆线溞生殖转化过程中对环境胁迫的分子响应提供了全面的认识。GO和KEGG分析表明在SF、PF和M中的特别生殖基因具有不同的富集条目。

GO功能分析表明：1）SF vs. PF：SF中富集条目主要是表皮相关（如表皮等的结构成分）、氧化应激（如氧化还原酶活性等）和血红蛋白（如血红素结合等）；相反，DNA包装（如核酸结合等）、转录（如转录调节等）和代谢过程是PF中最主要富集的条目。前者表明SF中上调的基因在形成保护性表皮结构以抵抗不利条件方面发挥重要作用（Pesch et al 2016），并在应对缺氧环境时增加氧气的转运和储存（Pirow et al 2001），后者表明PF中上调的基因可能有助于维持孤雌生殖雌体在不受精的情况下快速增殖（Arbačiauskas 2004），以及有助于新生幼溞生长过程中的的营养吸收。2）M vs. SF：M中富集的GO条目主要包括结构分子活性（如核糖体的结构成分）、转移酶活性、肽代谢过程（如翻译和肽生物合成过程）和糖基化；相反，氧化应激相关条目（如氧化还原酶活性等）、超氧化物代谢过程和激酶相关功能是SF中最主要富集的条目。值得注意的是它们都富集于表皮的结构成分功能。类似于SF vs. PF，与表皮结构成分相关的基因可能是产生保护性表皮结构以抵抗不利条件的关键因素（Pesch et al 2016），同时，一项研究表明几丁质和蛋白质是甲壳动物外骨骼的主要成分，糖基化是昆虫表皮中蛋白质的主要翻译后修饰之一（Kumari and Skinner 2010）。因此，可以假设M中与糖基化相关的基因可能负责产生前面提到的保护性表皮结构。先前的研究发现短日照诱导的蚤状溞中转移酶和岩藻糖基转移酶活性变化显著（Toyota et al 2015）。转移酶活性包括其他岩藻糖基转移酶或甘露糖基转移酶活性条目富集于M中，这些转移酶相关基因可能是M在不利环境下进行有性生殖期的重要调节因子。在甲壳类动物中，雄性性特征是由称为雄性腺体激素的肽激素诱导的（Okuno et al 2002）。因此，富集于M的肽代谢过程可能与雄性腺体激素的合成有关。此外，许多氧化应激相关条目在SF中富集且类似于M vs.PF，Sohal的研究表明氧化应激可能是衰老过程中的一个因素（Sohal 2002），因此推测有性生殖的出现可能与衰老有关。昆虫中的保幼激素可通过膜受体和蛋白激酶C（PKC）起作用以促进生殖腺的发育，并且甲壳类动物可产生与保幼激素类似的化合物，称为甲基法尼酯（MF），被认为在甲壳类动物的生殖和发育中起重要作用（Borst et al 2001）。因此，激酶相关条目富集于SF中表明这可能有助于性腺成熟以保障在有性生殖期间产生单倍体卵子。3）M vs. PF：M相关基因显著富集于多种GO类别，包括结构分子活性、信号受体活性（如G蛋白偶联受体活性等）和刺激过程（特别是与光转导相关的光刺激过程、检测等）；相反，大多数与转运蛋白活性、细胞周期调节和激酶相关功能的条目富集于PF。Grimmelikhuijzen的研究表明神经激素及其G蛋白偶联受体（GPCR）可以控制无脊椎动物的发育、生殖、体内平衡和行为等重要过程（Grimmelikhuijzen et al 2009）。因此，M中与G蛋白偶联受体活性相关的条目可能在隆线溞的生殖转化中起关键作用。而这些光刺激相关的基因可能涉及生殖转换中的光检测，先前的研究表明PKC是男性性别决定因素的候选因子，参与了水蚤类物种中与甲基法尼酯信号转导相关的雄性性别决定过程（Toyota et al 2017）。激酶相关条目富集于PF表明它可能负责PKC合成，并且涉及PF在不利环境中产生雄性。此外，细胞周期的调节可能与孤雌生殖雌体的快速增殖有关。

对于通路分析发现了几个值得注意的通路。在成对比较分析中发现PI3K-Akt和AMPK信号通路属于主要压力信号通路，分别在SF vs. PF和M vs. PF中上调，且之前的研究表明这些压力信号通路在氧化应激反应中被激活（Finkel and Holbrook 2000）。因此，这可能在调节细胞对环境胁迫的反应以及生殖转化中的正常生长和代谢起重要作用。一些研究表明节肢动物表皮的主要结构成分是几丁质、一种多糖以及蛋白质和脂质（Togawa et al 2004），而且几丁质参与昆虫细胞外基质（ECM）的形成（Gangishetti et al 2009）。因此，在与PF相比时，糖胺聚糖生物合成相关通路在SF和M中上调可能是它们引起SF和M表皮屏障的形成以抵抗不利的环境条件（Liu et al 2014b）。此外，与M相比，雌激素信号通路在SF中上调，由于有性卵（单倍体）需要受精，所以它可能负责生殖腺和卵母细胞正常发育以便隆线溞在不利环境下进行有性生殖（Banta and Wood 2010）。针对涉及生殖转化的关键基因，在下边根据类似功能分组进行了分析。

1）胶原蛋白相关基因

胶原蛋白是动物体内各种结缔组织细胞外空间的主要结构蛋白（Fields 1996），且有几篇报告表明胶原蛋白是甲壳动物肌肉的组成成分（Yoshinaka et al 1989; Mizuta et al 1994）。而目前的研究发现几种胶原蛋白相关基因在SF和M中上调，包括Col1a1、Col1a2、Col3a1、COL4A3（SF vs. PF）和Col1a1、MUC5AC、Sgs3（M vs.SF或PF）。在这些基因中，Col1a1、Col3a1、MUC5AC和Sgs3的功能是细胞外基质结构成分（Wenstrup et al 2004; Chiodo et al 1995; Meezaman et al 1994; Syed et al 2004），Col1a2和COL5A1的功能是胶原纤维组织（Malfait et al 2007; Bouma et al 2001）。在生物学中，由胶原蛋白、蛋白多糖等组成的细胞外基质（ECM）为周围细胞提供结构和生物化学支持（Birk and Bruckner 2011）。因此可以表明这些基因可能参与细胞支持以抵抗环境胁迫，保障SF和M在恶劣的环境条件下存活。

2）表皮相关基因

目前的研究发现几种表皮相关的基因在SF或M中显著上调，它们参与表皮结构成分的形成，包括1）：与PF相比Lcp65Ab1、col-91、Lcp5、LCP17、LCP22、CP10.9、CP19.8、SgAbd-8和PCP20在SF中上调表达；2）：与SF相比dpy-2和col-34在M中上调表达；3）：与PF相比col-34在M中上调表达；4）：与M相比CP10.9、PCP20和Edg78E在SF中上调表达。Lcp65Ab1和Lcp5是黑腹果蝇的表皮蛋白基因，参与以几丁质为基础的表皮的形成和发育（Charles et al 1997; Karouzou et al 2007）。与Lcp65Ab1和Lcp5相似，col-34与秀丽隐杆线虫中表皮的结构组成与基于壳脂蛋白的表皮的发育有关（Bird 1992）。此外，表皮蛋白基因LCP17、LCP22、CP10.9、CP19.8、PCP20和Edg78E分别参与了家蚕、蜱、烟草天蛾和黑腹果蝇中表皮的形成（Nakato et al 1997; Andersen and Roepstorff 2005; Hopkins et al 2000; Karouzou et al 2007）。节肢动物的表皮是几丁质和表皮蛋白的复合物，而几丁质是N-乙酰葡糖胺的均匀聚合物，蛋白质成分由多种表皮蛋白组成（Karouzou et al 2007），并且表皮是抵御环境胁迫的最重要屏障（Neville et al 1976）。在枝角类中，表皮也包含表皮蛋白，其可以抵抗恶劣的环境条件（Repka et al 1995）。此外，一项研究表明dpy-2参与秀丽隐杆线虫基于壳脂蛋白的表皮的形成（Levy et al 1993），并且表皮既可作为外骨骼，也可作为屏障以保护蠕虫免受环境影响（Page and Johnstone 2007）。总之，表皮相关基因的高表达表明这些基因可以帮助SF和M经历一系列相应的表皮结构变化以响应恶劣的环境来改善水蚤抵御恶劣环境条件的能力。

3）过氧物酶相关基因

在这项研究中，三个过氧化物酶相关基因（Pxt、PXDN和Pxd）在SF和M中高度上调表达：Pxt基因相对于M在SF中上调表达，PXDN基因相对于SF和PF在M中上调表达，Pxd基因相对于PF在M中上调表达以及Pxd基因相对于M在在SF中上调表达。过氧化物酶是一类在各种生物过程中起重要作用的酶。 Pxt具有卵巢卵泡细胞发育活性，并且是完成果蝇卵泡最后一次发育的必需基因（Tootle et al 2008）。Pxd编码果蝇绒毛膜过氧化物酶和参与绒毛膜硬化过程的特异性过氧化物酶（Konstandi 2005）。这些结果表明，这两个基因可能参与SF和M在有性生殖期间生殖细胞的发育，这有助于增加遗传多样性和在恶劣的环境中生存。此外，PXDN有较低的过氧化物酶活性，其在细胞外基质形成中发挥作用（Péterfi et al 2009）。这与胶原蛋白相关基因具有相似的功能，因此，可以认为PXDN基因可能有助于提高治枝角类抗不利环境的能力。

4）生殖相关基因

目前的研究发现几个与生殖有关的基因在SF和M中表现出显著的高表达，尤其是L(2)efl和dmrt1。SF与PF和M相比，L(2)efl基因在SF中上调表达；M与SF相比，dmrt1基因在M中上调表达。L(2)efl属于热休克蛋白Hsp20家族，称为小分子热休克蛋白（sHSPs），它作为分子伴侣具有保护蛋白质免于在高温胁迫下变性的作用（Van et al 2011），并且在氧化、生物种群密度高等其它压力条件下发挥保护作用（Wang et al 2007）。此外，sHSP在生物体的胚胎发育和免疫机制中也有重要作用，并且那些特异性sHSP基因可以抵抗对生物体的有害刺激并参与生殖、发育和正常代谢活动（Li et al 2009）。L(2)efl mRNA在黑腹果蝇的胚胎发生过程中广泛分布，L(2)efl蛋白在黑腹果蝇的晚期胚胎中具有肌肉特异性表达（Kurzik-Dumke and Lohmann 1985; Jagla et al 2014）。总之，L(2)efl可能是一个关键的调节因子，通过维持细胞稳态保护隆线溞免受各种环境胁迫刺激（如高温胁迫、氧化应激）。此外，L(2)efl也可能是恶劣环境条件下隆线溞胚胎发生的关键调节因子。dmrt1基因属于DMRT/dsx/mab-3家族，具有雄性性别决定功能。一些研究表明，DMRT1在多种具有不同性别决定机制的动物中是保守的（Western 1999），包括秀丽隐杆线虫（Raymond et al 1999）、果蝇（Nothiger et al 1987）、鱼（Marchand et al 2000）、爬行动物、鸟类和哺乳动物（Raymond et al 1999）。doublesex（dsx）基因在许多生物的性别决定中表现出高度保守性，并且已经在蚤状溞和大型溞中报道了两个dsx基因：Dpdsx1和DapmaDsx1，其负责雄性性状发育（Kato et al 2011）。在这里，dmrt1基因在隆线溞雄性中表现出性别偏向表达，这表明它具有与蚤状溞和大型溞相似的功能。进一步来说，dmrt1可能是雄性性状的调节因子，对隆线溞生殖转化过程中的性别决定起着决定性的作用。因为性别是由未成熟的卵母细胞在最终成熟卵裂前和发育中的卵子进入育幼室前决定的（Ignace et al 2010），所以l(2)efl和dmrt1基因可能与其他基因级联形成性别决定系统，来调节隆线溞的性别特征或作为双转换基因在不同的性别中进行选择。

3.4.2 miRNAs在隆线溞生殖转化中的生物学研究

随着生物信息学工具越来越多地应用于miRNAs的靶标预测和功能分析，一些研究已经证明miRNAs通过调节参与这些生理过程的基因在昆虫（如黑腹果蝇、埃及伊蚊等）的发育和生殖中起作用（Vilmos et al 2013; Lucas et al 2015）。然而，哪些miRNA及其靶基因在枝角类的生殖转化期间被精确调控尚不清楚。因此，本研究采用高通量测序方法对同一批隆线溞样品中的miRNA和mRNA进行整合表达谱分析，以更好地了解隆线溞生殖转化期间潜在的miRNA调控网络。这里使用隆线溞转录组数据集作为参考序列进行miRNA测序分析，该方法可以提供生殖转化期间miRNA功能的更多定性和定量描述。

在对小RNA数据进行全面分析后，基于隆线溞的转录组数据鉴定出了47个miRNAs，包括39个保守的miRNAs和8个新的miRNAs，其中39个保守的miRNA属于31个已知的miRNA家族（除3个没有miRNA家族信息的miRNA）。在保守的miRNA家族中发现bantam、miR-iab-4、miR-7、miR-33、miR-124和miR-252家族成员可能在隆线溞的生殖转化过程中起重要作用。Boulan等人发现bantam在果蝇幼虫发育过程中下调了蜕皮激素信号转导通路（Boulan et al 2013）。尽管如此，这里检测到的bantam可能是其在环境压力引发的隆线溞蜕皮激素信号转导的复杂调节网络中的活性标志。已知一种特定的miRNA：mir-iab-4在黑腹果蝇的发育中起调节作用（Ronshaugen et al 2005）；据报道，miR-7与果蝇卵母细胞和早期胚胎有关（Lasko 2011; Vilmos et al 2013）；miR-124在性别决定通路中发挥作用并且在果蝇成年阶段赋予sexual identity和reproductive fitness方面发挥重要作用(Weng 2013)；miR-252被预测调节果蝇的成虫盘形态发生（Marrone et al 2012），并且被预测靶向一些直接与水蚤蜕皮有关的表皮蛋白（Otte et al 2014）。因此，可以假设这些miR家族成员可能作为调控因子，在隆线溞生殖转化的复杂调节网络中发挥关键作用。

差异miRNAs表达分析表明保守的和新的miRNAs在隆线溞的生殖转化过程中受到差异调节。有趣的是，这些DEMs仅在M vs. SF或PF中出现差异调节。M与SF或PF相比，dpu-miR-252a和novel-miR-5在M中均上调表达，dpu-miR-279b和dpu-miR-375在M中均下调表达。此外，M与SF相比，dpu-miR-133和dpu-miR-31在M中上调表达，dpu-miR-34、dpu-miR-993和dpu-miR-965在M中下调表达；M与PF相比，novel-miR-6在M中上调表达，novel-miR-1在M中下调表达。因此，似乎在隆线溞生殖转化过程中调控miRNA表达的模式依赖于其特定个体。

鉴定miRNAs的靶基因对于将生殖状态特异性miRNA调节因子与生物功能联系起来是至关重要。因此，我们给出了基于转录组的差异miRNA靶基因分析，进行了差异miRNA靶基因的GO和pathway富集分析。结果表明：1）：GO注释显示这些推定的靶基因似乎参与了广泛的基本生物学过程，并且难以明确概括miRNA靶基因在生殖转化过程中的调控作用；2）：ras和notch通路在果蝇胚胎中胚层起着相互调节的作用（Carmena et al 2002），ras和notch通路分别在M和SF中富集，这表明ras和notch通路可能在隆线溞的胚胎发育中作为一个调控因子；Sex-lethal是黑腹果蝇性别决定的主开关且Hedgehog通路调节Sex-lethal（Vied and Horabin 2011），因此M中的miRNA靶基因富集于Hedgehog通路可能涉及隆线溞的雄性性别决定；M中的光转导通路可能参与光介导的生殖转化，因为光循环的变化是诱导枝角动物生殖转化的重要因素（Baer and Ovens 1999）。有趣的是在M中存在卵母细胞减数分裂通路，很难理解M在生殖转化过程中发生了什么。因此，这些可能与生殖转化有关的特异性miRNA靶基因的功能验证将在未来的研究中发挥重要作用。

3.4.3 整合miRNA-mRNA分析

对miRNA表达谱及其靶基因的整合分析有助于鉴定参与调节特定生物过程的功能性miRNA/mRNA模块（Tao et al 2016）。因此，进行了miRNA和mRNA表达水平的转录组范围的整合分析以鉴定在隆线溞生殖转化期间被调节的miRNA-mRNA对。整合分析发现有40对表达谱呈负相关的miRNA-mRNA和55对表达谱呈正相关的miRNA-mRNA。在这95对miRNA-mRNA中，发现了一个中枢基因Lrp2，它可能在调节隆线溞生殖转化应激反应基因的调控网络中发挥核心作用。低密度脂蛋白受体相关蛋白2（Lrp2）在小鼠的生殖器官发育中发挥作用，并具有类固醇激素受体结合活性（Hammes et al 2016），Lrp2是M与SF比较的网络中dpu-miR-252a、dpu-miR-279b和dpu-miR-375的靶标，因此，dpu-miR-252a—Lrp2（正调控）、dpu-miR-279b—Lrp2（负调节）和dpu-miR-375—Lrp2（负调节）调节模块可能参与促进性腺发育以促进M在不利条件下的有性生殖。在与SF或PF相比中，dpu-miR-375在M中均下调表达，而DapmaDsx1-a作为其靶基因在M中均上调表达。Kato等已经证明DapmaDsx1是大型溞雄性表型的关键调控因子（Kato et al 2011），此外，Dmrt基因编码以存在DM结构域为特征的大家族转录因子，因其在节肢动物性发育中的重要作用而广为人知（Bellefroid et al 2013）。这一结果可能支持dpu-miR-375—DapmaDsx1-a调节模式参与隆线溞性别决定机制的假设。在M与PF比较时，novel-miR-6作为一种新的miRNA在M中上调，它可能是隆线溞生殖转化过程中的关键调节因子。GRIK2（Glutamate receptor ionotropic, kainate 2）和Ocin01_04175（Compound eye opsin BCRH2）作为其正向调控靶标，novel-miR-6—GRIK2和novel-miR-6—Ocin01_04175可能是生殖转化机制中的关键调节模块。因为据报道离子型谷氨酸受体（Glutamate receptor ionotropic）的激活对蚤状溞的雄性后代产生至关重要（Toyota et al 2015），并且Ocin01_04175具有光感受器活性，已经证明光感受器基因在周期性孤雌生殖甲壳类动物大型溞的休眠期诱导中起重要作用，休眠期诱导是与有性生殖有关的表型可塑性生活史特征（Roulin et al 2016）。miRNA不仅是基因表达的调控因子，而且通过它们在遗传网络中的广泛整合在协调复杂的生物过程中发挥着至关重要的作用。在本研究中，这些miRNA/mRNA调控模块可以为阐明隆线溞生殖转化的调控机制提供资源。

3.5小结

本研究发现了一系列由转录组和miRNA的整合分析鉴定出的不同生殖个体间差异表达的mRNA和miRNA。结果表明1）：与隆线溞生殖转化相关的基因主要属于胶原蛋白相关家族、表皮相关家族、过氧物酶相关家族和生殖相关基因，差异表达基因富集的主要功能与保护性表皮结构形成、氧气的转运和储存、性腺发育和雄性性别决定有关，主要通路与应对环境胁迫反应、表皮屏障的形成和生殖腺与卵母细胞正常发育有关；2）：bantam、miR-iab-4、miR-7、miR-33、miR-124和miR-252家族的miRNA可能在隆线溞生殖转化过程发挥重要作用；3）：几对miRNA-mRNA可能是调节隆线溞生殖转化生物过程（性腺发育、雄性性别决定）的功能性模块，如dpu-miR-252a—Lrp2、dpu-miR-279b—Lrp2、dpu-miR-375—Lrp2、dpu-miR-375—DapmaDsx1-a、novel-miR-6—GRIK2和novel-miR-6—Ocin01_04175调控模块。