3+2生信分析模式下对肠道微生物的解读|Metabolic modelling reveals the aging-associated decline of host–microbiome m...

文献解读概述

这篇文献发表在 Nature Microbiology (2025 年 4 月，Volume 10, pp. 973–991)，标题为 Metabolic modelling reveals the aging-associated decline of host–microbiome metabolic interactions in mice。作者团队来自德国多家机构（如 Kiel University、Jena University Hospital 等），通讯作者为 Christoph Kaleta。

文献核心内容

• 研究背景与目的：衰老伴随肠道微生物组的显著变化，但微生物组与宿主衰老的分子机制尚不清楚。文章结合宏基因组学、转录组学和代谢组学数据，使用代谢建模（metabolic modelling）来表征小鼠衰老过程中宿主-微生物组的代谢互动。重点揭示了微生物组代谢活性下降如何导致宿主代谢变化（如核苷酸代谢下调、肠道屏障功能减弱和系统炎症增加），并提出这些路径可作为未来抗衰老疗法的靶点。
• 实验设计：使用 52 只雄性 C57BL/6J/Ukj 小鼠（年龄从 2 月到 30 月，代表成年到晚年），采集粪便（用于宏基因组）、结肠/肝脏/脑组织（用于转录组）。额外有无菌（germ-free）小鼠队列用于验证微生物组依赖的宿主基因。总数据包括：167 Gbp Illumina 短读序（shotgun）和 13.7 Gbp PacBio 长读序（long-read）。
• 关键发现：
  • 重建了 181 个宏基因组组装基因组（MAGs），主要来自 Bacillota 和 Bacteroidota 门。
  • 微生物组代谢活性随年龄下降，伴随有益菌间互动减少和宿主炎症增加。
  • 宿主-微生物组互动主要涉及核苷酸、维生素和短链脂肪酸代谢；衰老导致这些互动减弱。
  • 使用约束-based 代谢建模（如 FBA）和 EFMs 采样预测互动，并通过无菌小鼠和代谢组数据验证。
• 意义：文章强调微生物组是宿主衰老的重要驱动因素，提出基于微生物组的抗衰老疗法潜力。方法整合多组学数据，提供了一个从宏基因组到代谢网络的系统框架。
• 局限性：仅使用雄性小鼠；MAGs 质量中等（80% 完整性，<10% 污染）；建模依赖人类代谢重建（Recon 2.2），可能有物种偏差。

文章结构：引言、结果（MAG 重建、宿主-微生物关联、衰老变化）、讨论、方法（详细生信流程）。补充材料包括扩展数据图和表格（如 Supplementary Table 1.2 为 MAG 元数据）。

生信分析方法解读（重点聚焦 Illumina + PacBio 的 binning）

文章的生信分析主要围绕宏基因组数据处理、MAG 重建、代谢建模和多组学整合。以下按流程分步解读，特别强调用户关注的 Illumina 二代短读序 + PacBio 长读序的 hybrid binning。这些细节主要来自文章的 Methods 部分（页面 11-13 和补充方法）。

1. 数据采集与质量控制（Sequencing & QC）

• 测序平台：
  • Illumina shotgun sequencing：使用 Illumina NexteraXT Library Kit 制备文库，52 个样本在 Illumina NextSeq 500 上测序（2 × 150 bp paired-end，总 167 Gbp）。每个样本的读序合并后进行 QC。
  • PacBio long-read sequencing：在 FLI Leibniz Institute 使用 SMRTbell Template Prep Kit 制备文库（剪切到 75 kb，BluePippin 大小选择 >6 kb）。8 个年龄匹配的样本池化，在 PacBio RSII 上测序（平均读长 7.8-9.7 kb，总 13.7 Gbp）。输出为 circular consensus sequences (CCS) 和 subreads。
• 质量控制（QC）：
  • Illumina 读序：使用 Cutadapt (v1.12) 去除适配器（≥3 bp 重叠，Phred+33 <30 剪切 3' 端）；Prinseq lite (v0.20.4) 滑动窗口过滤（步长 5 bp，窗口 10 bp，平均质量 <30，最小长度 50 bp）。
  • 去除宿主污染：Bowtie (v2.2.5) 映射到小鼠参考基因组 (GRCm38.99)，保留未映射读序。
  • PacBio 读序：直接使用 SMRTportal 处理成 CCS 和 subreads，无额外过滤（但在 assembly 中使用 filtered subreads）。
  • 结果：无显著年龄组间读序深度或污染差异（Kruskal-Wallis 测试 + Dunn's post-hoc）。

2. 组装与 Binning（Assembly & Binning） - 用户重点

• Hybrid Assembly（混合组装）：这是关键步骤，使用 Illumina 短读（高覆盖）和 PacBio 长读（高分辨率）结合，提高 MAG 质量和完整性。
  • 工具：metaSPAdes (SPAdes v3.13.1) 在 hybrid 模式下运行，k-mer 大小为 21、33、55、77。
  • 输入：
    • Illumina：所有样本的 QC 后 paired-end 读序（forward + reverse 合并）。
    • PacBio：8 个长读库（filtered subreads + CCS）。
  • 输出：全队列 scaffolds（总 367 Mbp）。
  • 过滤：最小长度 1,000 bp，覆盖深度 ≥7.7815（基于 coverage vs. length 散点图确定阈值，参考 Bowers et al., 2017）。
• Mapping Back：QC 后 metagenomic 读序用 Bowtie (v2.2.5) 映射回 filtered scaffolds（插入大小 0-1,000 bp，very sensitive，非确定性，fr stranded，end-to-end）。计算覆盖深度用 MetaBAT 的 jgi_summarize_bam_contig_depths。
• Binning（分箱）：使用多工具方法，提高准确性。
  • 工具：
    • MetaBAT (v2.12.1)：基于覆盖深度和 tetranucleotide 频率。
    • CONCOCT (v1.1.0)：scaffolds 切成 10 kbp chunks。
    • MaxBin (v2.2.4)：基于 Markov 模型。
  • 总 bins：252 个（3 个工具结合）。
• Bin Refinement & Quality Check：
  • 精炼：DAS Tool (v1.1.2) 整合 3 个 binner 的结果。
  • 质量评估：CheckM (v1.1.2)，选择 ≥80% 完整性（completeness）和 ≤10% 污染（contamination）的 bins（181 个 MAGs）。其中 25 个为 high-quality（>90% 完整，<5% 污染，含 23S/16S/5S rRNA 和 ≥18 tRNA），其余 medium-quality。文章使用较宽松阈值以覆盖更多物种，但强调对代谢建模影响小（gap filling 可补偿）。
  • 为什么 hybrid binning？Illumina 提供高覆盖（准确性），PacBio 解决重复序列和 contig 连接，提高 MAG 完整性（genome size 0.9-6.7 Mbp）。结果：MAGs 主要来自 Bacillota (97) 和 Bacteroidota (65)，丰度 >1% 的多为 Muribaculaceae。
• 注释（Annotation）：
  • 分类：GTDB-Tk (v2.1.1, database r214)，175 个匹配已知 taxa，6 个未知 (UNK_)。
  • tRNA：tRNAscan-SE (v2.0.9)。
  • 16S rRNA：barrnap (v0.9, bacteria mode)。
  • 丰度计算：MAG 平均覆盖深度，标准化后与年龄相关（线性模型，FDR ≤0.05）。

3. 代谢建模与功能分析（Metabolic Modelling）

• MAG 到代谢网络：gapseq (v1.2) 重建 genome-scale 代谢模型（gap filling 启用）。营养输入基于小鼠饲料 (V1534-300)，假设日摄入 3.5 g。
• 社区 FBA：使用 sybil 和 MicrobiomeGS2 (CPLEX solver) 预测微生物生长率和互动。生态关系用 EcoGS 包分类（竞争、寄生等）。
• 宿主-微生物整合：Recon 2.2 (人类代谢重建) 代表宿主组织（结肠/肝/脑），结合微生物模型成 metamodel。使用 fastcore (v1.0) 构建上下文特异模型；EFMSampler 采样 elementary flux modes (EFMs) 预测互动。
• 增长率验证：CoPTR 基于 peak-to-trough ratio (PTR) 从 MAGs 估计增长率，与 FBA 相关。

4. 多组学整合与统计（Multi-Omics Integration）

• 转录组：DESeq2 (v1.40.2) 归一化（variance-stabilizing transformation），ppcor (v1.0) 计算部分相关（Spearman，校正年龄/批次）。
• 功能注释：GO (生物过程)，MetaCyc (途径)。超几何测试 (phyper) 富集，FDR 校正。
• 衰老相关：线性模型相关年龄变化；无菌小鼠验证微生物依赖基因。
• 代谢组：独立队列 (83 只小鼠)，HILIC-UPLC-MS/MS 测量粪便代谢物，验证模型预测。
• 统计：Kruskal-Wallis, Dunn's test, Benjamini-Hochberg FDR 等（R 包如 DescTools）。

5. 个人总结：Illumina + PacBio Binning 的优势与注意

• 优势：Hybrid assembly (metaSPAdes) 结合短读准确性和长读连续性，提高 MAG 质量（减少 gaps）。多 binner + DAS Tool 减少假阳性。结果：181 个可靠 MAGs，用于下游代谢建模。
• 潜在问题：PacBio 数据量少 (13.7 Gbp vs. 167 Gbp)，可能覆盖不均；阈值主观（覆盖 7.7815）；中等质量 MAGs 需 gap filling。
• 可复现：所有代码/数据在 Zenodo 存档；补充表格详尽。

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